无抗生素选择系统综述.doc

无抗生素选择系统的发展现状 摘 要 在我国，滥用抗生素的现象十分普遍，导致抗生素耐受基因基因的泛滥。其实，不止抗生素的滥用，在一些食品菌的生产、质粒DNA的生产、DNA疫苗的生产等多方面都会使用含抗生素的选择系统，这些都会导致抗生素耐受基因的传播。尤其是在生物药品领域，一种含有抗生素耐受基因载体的重组生物药物是完全不可取的，因此，无抗生素选择系统的发展是势在必行的。本文简介了无抗生素选择系统的发展现状。 关键词：无抗生素选择；耐受基因；DNA疫苗；质粒DNA；重组 The development of Antibiotic-free selection system Abstract In China, the widespread abuse of antibiotics leads to the spread of antibiotic resistance genes. In fact,not only the abuse of antibiotics, some bacteria in food production, the production of plasmid DNA and DNA vaccine,all of them will use the antibiotic selection system which can lead to the spread of antibiotic resistance genes. Especially, in the field of bio-medicine, an recombinant biological drug containing antibiotic resistance gene vector is unacceptable totally, and therefore, the development of antibiotic-free selection system is imperative. This article introduced the development of the antibiotic-free selection systems. Keywords：antibiotic-free selectionTolerance gene; DNA Vaccine; Plasmid DNA; Restructuring 前言 细菌的每一种耐药机制都由不同的耐药基因所控制，这些耐药基因可由突变产生，也可以通过增殖过程垂直传播，或者通过质粒、噬菌体、转座子等可移动的遗传物质在相同或不同种属细菌间水平传播。环境中细菌耐药基因的存在和抗菌药物的使用是影响细菌耐药性形成和发展的两个主要因素。抗生素耐药性基因的完全缺失是确保在环境中抗生素抗性基因不传播或转化到致病菌株中产生抗性的唯一方法[1]。目前已经试验成功的无抗生素选择系统主要在DNA疫苗和基因药物、食品菌和转基因植物的生产研究等方面。 技术方法 1.DNA疫苗和基因药物 DNA疫苗和基因药物正在成为一种重要的药品类，然而，这种从细菌质粒衍生出来的药物在质粒DNA的分离纯化方面一直是工业化生产的难题，而且由于各种理论安全问题，监管机构一直不建议使用抗生素抗性标记的DNA疫苗。因此，新的无抗生素选择系统的研发已经势在必行。 1.1自溶系统分离质粒DNA 为了解决DNA疫苗在下游纯化方面的难题，Aaron E. Carnes等人研发了一种新颖的宿主菌株在细胞质中表达噬菌体內溶素的自溶大肠杆菌系统。这种系统在发酵过程中通过热诱导启动子诱导表达內溶素。內溶素保留在细胞质中，在细胞壁中肽聚糖基板上分离；因此细胞保持完好，可用通常的方法收获。然后回收的质粒DNA在微酸性环境下自溶提取，低盐缓冲液条件下用低浓度的无离子型去垢剂处理。在这些条件下，大肠杆菌的基因组DNA与不溶性的细胞碎片仍连在一起，然后由固液分离法分理出质粒DNA[2]。 1.2 利用RNA-OUT的系统 为了解决DNA疫苗的抗生素安全问题，Luke等人[3]提出了一种新方法，此方法设计并合成抗原基因克隆到RNA-OUT上编码无抗生素DNA疫苗载体，同时优化提高蛋白的表达和免疫原性，以替代其他卡那霉素抗性的载体。其简要过程为，首先在抗原免疫反应背景下考虑抗原靶向问题，其方法为通过主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类基因指导抗原表达；例如ntc868系列RNA-OUT载体系统允许同时克隆到多个载体细胞内的不同的转基因目的地上。然后设计密码子优化和基因合成的详细流程图。最后就是克隆转基因到NTC868系列RNA-OUT载体系统上。最后得到的无抗生素DNA疫苗载体是更有效的卡那霉素抗性标记编码载体的安全替代品。 1.3基于营