第六节蛋白质的重要性质档详解.doc

第六节 蛋白质、氨基酸的 分离纯化与测定 一、蛋白质的酸碱性质 １两性解离：蛋白质是多价离子，其解离情况比较复杂。可解离基团主要来自侧链基团上的各种功能基团。 ２等电点：净电荷为０时的pH称蛋白质的等电点。 等电点时蛋白质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压均最小。 可以用其等电点时溶解度最小来分离和纯化蛋白质。 蛋白质在偏碱溶液中（PHPI）带负电荷，在偏酸溶液中（PHPI）带正电荷。 二、蛋白质分子大小与分子量测定 （一）根据化学组成测定蛋白质的分子量 （二）渗透压法测定分子量 （三）蛋白质的扩散与扩散系数 （四）沉降分析法 （五）凝胶过滤法测定相对分子量 三、蛋白质胶体性质和蛋白质的沉淀 （一）胶体性质 分散质点在1~100nm范围内 蛋白质是一种亲水胶体，分子表面的亲水基在水中起水化作用，蛋白质在适当条件下可带相同的正电荷，与周围的反离子构成双电层，蛋白质作为胶体稳定，无外界影响，就不互相聚集而沉淀 （二）蛋白质的沉淀现象 1、盐析法：中性盐使蛋白质脱去水化层而凝聚沉淀。 2、有机溶剂沉淀： 甲醛、乙醇、丙酮 引起蛋白质脱去水化层，降低介电常数，增加质点间的相互作用引起沉淀。 3、重金属盐沉淀：大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，容易与金属离子形成不溶性的盐。 误服重金属盐的病人可以口服大量的牛乳和豆浆等蛋白质进行了解救 它能和重金属离子形成不溶性盐，再服催吐剂排出体外。 4、生物碱类沉淀蛋白质 PHPI 蛋白质带正电荷，容易与生物碱试剂生成盐类沉淀 生物碱试剂指引起生物碱沉淀的一类试剂如单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸。 5、加热变性沉淀法 加热使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层；少量盐可以加速蛋白质凝固，如豆腐制作工艺 四、蛋白质分离纯化的一般原则 1、生物材料的前处理 分离纯化蛋白质，首先将蛋白质从原来的组织细胞中以溶解状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性，常用的方法有以下几类： （１）机械破碎法：利用机械剪切作用，将细胞研碎。如玻璃匀浆器、组织捣碎机、研钵等。 （２）渗透破碎法：利用低渗使细胞溶胀破碎。例如将红细胞放入水中便发生自溶。 （３）交替冻融：将生物组织冻结后，细胞内容物使细胞涨破。 （４）超声波法：超声振荡，使细胞膜上受张力不均匀而解体。 （５）酶消化：利用蛋白酶、溶菌酶、纤维素酶等对细胞壁和膜的分解作用使他们解体。 2、粗分级 处理量大,既能除杂质,又能浓缩 盐析、超过滤、凝胶过滤、冷冻干燥等方法 3、细分级 规模较小，但分辨率高，如采取层析和电泳等方法。 五、蛋白质混合物的分离方法 依据：分子的大小；溶解度；电荷；吸附性；对其它生物分子的亲和力。 （一）根据分子大小不同的和分离法： 1、透析和超过滤原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 常用的半透膜是玻璃纸和火棉和其它合成材料。 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋中放在蒸馏水中进行 透析外液可以更换，直到透析袋里无机盐等小分子物质降低到最小值为止。 超过滤是利用压力和离心力，强行使其它小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上。 透析：古老方法、时间长 超过滤：高级，较重要 2、离心 蛋白质分子颗粒的沉降取决于其分子大小，如：差速离心。 3、密度梯度离心： 蛋白质分子颗粒的沉降不仅取决于它的大小，而且决定与它的密度。 如果蛋白质在具有密度梯度的介质中离心，质量密度大的颗粒比质量密度小的颗粒沉降的快。 并且每一种蛋白质颗粒沉降，与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前。 最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区段。 生成的区段可在底部刺一个小孔处地方流出，分部收集，每个组份进行小样分析以已确定取代的位置。 核酸分离用得多，常规用得不多。 4、凝胶过滤的原理： 当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，随着溶剂在凝胶球间隙中向下移动并最先流出柱外，比孔径小的分子不同程度地进入凝胶珠内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。 大分子先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱来 （二）利用溶解度差别的分离方法： 影响蛋白质溶解度的外界因素有溶液的pH值离子强度、介电常数、温度。 在同一的特定的外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度，这取决于它本身的结构，如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团疏水基团的比例及其排列方式。 根据蛋白质分子的结构特点适当改变外界条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。 １等电点沉淀：蛋白质分子是两性电解质，