荧光测定维生素c讲述.pptx

荧光分析法测定维生素 C 维生素 C及维生素C 的测定原理 荧光分析法测定维生素 C实验 荧光分析法测定维生素 C 应用 讲解人：贺政轩 一、维生素 C及维生素的测定原理 1.1维生素C 维生素 C 又名抗坏血酸, 是维持机体正常生理 功能的重要维生素之一,而人体不能自身合成 ，只能 从食物和药物中摄取，因此 ，食品、药物中维生素 C 的分析具有重要意义。 1.2维生素C测定方法 维生素 C 的测定常用的方法有光度法 、 电化学法、滴定法、酶法、色谱法等。 本实验提出了一种新的测定维生素 C 的荧光 分析方法：维生素 C 被 Cu2 +氧化为脱氢 抗坏血酸，再与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作用，通过对体系荧光强度的测定进行维生素 C 的定量分析。 二、荧光分析法测定维生素 C实验 1实验 1. 1 主要仪器与试剂 ? 　　 分子发光仪 :LS - 55 型 ?　　酸度计 :pH - 211型 　　 榨汁机 :CW - JE04型 ?　　电热恒温水浴锅 :HH. SY11 - N i1型 ?　　 CuSO4溶液 :2. 0 ×10- 3 g m/ L ?　 十六烷基三甲基溴化铵 (CTMAB )溶液 :6. 0 × 10- 4 g /mL 苯甲酸溶液：1. 0 ×10- 4 g m/ L 维生素 C 标准储备液 :5. 0 ×10- 4 g /mL, 2 ～ 8℃ （避光保存）； ? 维生素 C 标准溶液 :1. 0 ×10- 5 g /mL, 2 ～ 8℃ （避光保存）； ? NaOH -邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液:pH =6. 0；　　 1. 2 实验步骤 ? （1）配置待测样品及空白对照 　 在 25 mL 比色管中依次加入 0. 6 m L CuSO4 溶液，2. 0 m L十六烷基三甲基溴化铵溶液，2. 0 m L 苯 甲酸溶液 ，一定体积的维生素 C 标准溶液 ，5. 0 mL NaOH -邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液, 用蒸馏水定容，摇匀；以不含维生素 C 溶液为 空白对照。 （2）水浴加热 在 35℃恒温水浴中加热 30 m in， 将溶液流水 冷却至室温 。 （3）荧光分析 将待测样品放置于样品架上，设定激发波长为 308 nm ，发射波长为 408 nm ，测量荧光强度 F ，以不含维生素 C 的试剂空白为 F0 ，计算 F测 =F - F0 。 2 结果与讨论 ? 2. 1 激发光谱和发射光谱 ? 　　取 3. 0 mL 维生素 C 标准溶液, 按实验方法进 行操作,分别在 290 ～ 330 nm、360 ～ 460 nm 内扫描 得到激发光谱和发射光谱如图 1、图 2所示。从图 1、图 2中可看出 ,当激发波长为 308 nm , 发射波长 为 408 nm 时体系的荧光强度最大,试剂空白的荧光 值比较低且稳定, 故本实验选择激发波长为 308 nm ,发射波长为 408 nm 。 ? 1— C u2 + +BA +缓冲溶液 +CTMAB; 2— Cu2 ++BA +维生素 C +缓冲溶液 +CTMAB 1— C u2 + +BA +缓冲溶液 +CTMAB; 2— Cu2 ++BA +维生素 C +缓冲溶液 +CTMAB 激发光谱 发射光谱 2. 2 试剂加入顺序 ? 　　按照实验方法操作, 在各试剂加入量相同的情况下, 试验了试剂的不同加入顺序对荧光强度的影 响。试验结果表明, 当所加试剂顺序依次为 CuSO4 溶液、苯甲酸溶液、维生素 C 标准溶液、NaOH -邻 苯二甲酸氢钾缓冲溶液时 ,体系的荧光强度最大，因此选用此加入顺序为最佳试剂加入顺序。 2. 3 缓冲溶液 　　 溶液的pH值对体系荧光强度有较大的影响，试验了不同的pH值对荧光强度的影响。由pH值 —荧光强度的曲线可知 , 当 pH 值为 5. 9 ～ 6. 2 时 ,荧光强度达到最大值且比较稳定 ,因此确定最佳 pH 值为 6. 0。 　　缓冲溶液的种类对体系的荧光强度也有一定的影响。试验了以下几种 pH 值为 6. 0 的缓冲溶液 : NaOH - KH 2 PO4 、KH2 PO4 - 硼砂、KH2 PO4 - Na2 H PO4 、NaOH - 邻苯二甲酸氢钾、Na2 H PO4 - 柠檬 酸、NaOH -柠檬酸钠、HA c - NaA c等。试验结果表明 ,当所加的缓冲溶液为NaOH -邻苯二甲酸氢钾时,荧光强度最大且稳定。因此本实验选择NaOH - 邻苯二甲酸氢钾为缓冲溶液 ,其最