2.荧光光度法测定维生素B2的含量.docx
文本预览下载声明
实验五 荧光光度法测定维生素B2的含量
一、实验目的
1、学习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理;
2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定维生素B2的方法。
二、实验原理
1.荧光光度法原理
(1)常温下,处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子,激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级,再以辐射跃迁的形式回到基态,发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中,荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系:
当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系:
这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
(2)荧光分析法的特点:
a. 与紫外-可见分光度法比较,荧光分析法具有更高的灵敏度。
b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱,又能依据吸收光谱来鉴定物质。
c. 所需试样量少、操作方法简便。
(3)荧光光谱
激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多,荧光强度最大。
发射光谱:固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描,找出最大激发光波长,然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描,找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
(4)荧光分析仪器
常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成,如下图所示:
I0
液槽
显示器
单色器
检测器
I0
I
If
光源
单色器
2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量
维生素B2(又叫核黄素,VB2)是橘黄色无臭的针状结晶,其结构式为:
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂,在中性或酸性溶液中稳定,光照易分解,对热稳定。维生素B2溶液在430~440 nm蓝光的照射下,发出绿色荧光,荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6~7的溶液中荧光强度最大,在pH=11的碱性溶液中荧光消失,所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。
多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖,其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发???光,维生素B1本身无荧光,在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光,维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光,他们都不干扰维生素B2的测定。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素,光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多,故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内,且在避光条件下进行。
三、试剂与仪器
仪器:970CRT荧光光度计,5 ml吸量管1只,2 ml吸量管1只, 50 ml容量瓶6只, 100 ml容量瓶1只,
试剂:10.0μg/ml(实际浓度请自己记录)维生素B2标准溶液,冰乙酸,试样若干
四、实验步骤
970CRT荧光光度计的基本操作
1. 先打开氙灯,再打开主机,然后打开计算机电源,荧光光度计工作站自动启动并初始化仪器,预热20—30min
2. 仪器初始化完毕后,在工作界面上选择测量项目,设置适当的仪器参数例如:设置激发波长为440nm,发射波长为330 nm,灵敏度=2,入射缝宽和出射缝宽均为10nm。
3. 样品测定
(1)标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定:
? 在6个干净的50 ml容量瓶中,分别吸取0.50、1.00、1.50,2.00,2.50和3.00维生素B2标准溶液,各加入2.00 ml冰乙酸,稀释至刻度,摇匀。得到不同浓度的溶液分别是:0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6ug/ml的维生素B2溶液,从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。
(2)未知试样的测定:
准确称取一片维生素B2片,用研钵研细,加少量水溶解后(不得超过定容体积),将其全部转入50 ml比色管中,于超声振荡器中超声溶解后,定容。
将超声分解后的样品试液经0.45μm膜过滤后,准确取滤液适量置于50 ml比色管中,加2.00 ml冰乙酸,稀释至刻度,摇匀。用测定标准系列时相同的条件,平行测量其荧光强度3次。
(黑体字部分实验报告中请按自己实际操作撰写)
4.定性实验:改变狭缝宽度、灵敏度、扫描速度,记录发射光谱曲线,进行实验条件的讨论。
5. 退出主程序,关闭计算机,先关主机,最后关氙灯。
?
五、实验结果及数据处理
1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线
2.根据待测液的荧光强度,从标准工作曲线上求得其浓度,计算出试样中含量。
六、思考题
1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因?
2. 维生素B2在pH=6~7时荧光最强,本实验为何在酸性溶液中测定?
3. 如何绘制激发光谱和荧光发射光谱?
五.实验结果及数据处理
1用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线
表一
CB2/μg/ml0
显示全部