用于毕赤酵母菌种筛选的快速发酵技术的开发..doc

珠海联邦制药股份有限公司 技 术 创 新 项 目 申 请 书 项目名称：申请人： 申请时间：2014年月用于毕赤酵母筛选的快速发酵技术的开发 一、简述 鉴于毕赤酵母发酵周期长，而且由于工作任务的安排，菌种开发组构建的菌种越来越多，如采用目前筛选菌种的单一的发酵工艺来试验菌种，虽然花费大量时间能筛选个别高产菌种，但不能快速高效地筛选出高产菌种，从而积累菌种，不能按时完成工作任务，也不能准确全面地筛选高产菌种。针对这一情况，特开发一种高效筛选毕赤酵母的快速发酵工艺来筛选菌种。 高效筛选毕赤酵母的快速发酵工艺的优点有：（1）短时高效，只需1个月就可以筛选出6个菌种，甚至更多；（2）通用性强，可以全面试验摇瓶中表达量相近的菌种，适合任意的毕赤酵母菌种的筛选，且不会出现漏选的现象；（3）系统性强 ，多元紧密的工艺可以准确地筛选出高产稳定菌种。 目前国内对于发酵罐筛选菌种的发酵工艺比较少，其中与其相关和做得比较好的有：5L发酵罐中进行3种甲醇流加策略，最终hALR表达水平为360mg/L【平续斌等，甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响. 中国医药工业杂志.[1]。碱性果胶酶研究中诱导时进行了不同的甲醇流加策略，酶活最高可达430000U/L【 重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略. 2008, 24（4）：635-639】[]。目前，菌种发酵小组已经做了部分相关的预实验，初步得到一些可支持这一技术的结果。 二、目前工艺存在的问题 菌种开发组已经采用目前的毕赤酵母菌种筛选的发酵工艺长达三年，通过优化发酵工艺虽然能筛选出个别发酵潜力较高的菌种，但目前还存在许多问题，主要包括： （1）采用该发酵工艺筛选毕赤酵母菌种效率低、时间长，只适合筛选1个毕赤酵母菌种。 （2）该发酵工艺通用性差，不能全面筛选经过摇瓶筛选表达量相近的菌种，不能判断菌种利用甲醇的快慢，导致漏筛了发酵潜力较高的菌种。 （3）该发酵工艺单一，不能确定该工艺是否最适合筛选该菌种，筛选菌种准确度不高。 （4）该发酵工艺不稳定，目前同一菌种同一工艺的发酵结果差异较大。 三、研究方案 针对目前筛选毕赤酵母的发酵工艺存在的问题，提出了以下的解决方案。 方案一：确定起始发酵培养基的甘油浓度的预实验 方案概述：为了缩短毕赤酵母发酵周期，简化操作，提高效率，而进行这一摸索试验。主要用单因素实验法确定发酵培养基起始的甘油浓度，过程中不补甘油。直接流加定量的甲醇诱导。 实验方案： 1）起始发酵培养基的甘油浓度为40g/L，过程中不补甘油，诱导后，转速和通气量维持不变，分别流加甲醇浓度为10ml/L的甲醇进行诱导，每当DO反弹后，流加定量的甲醇量，直到发酵结束。 2）起始发酵培养基的甘油浓度为60g/L，过程中不补甘油，诱导后，转速和通气量维持不变，分别流加甲醇浓度为10ml/L的甲醇进行诱导，每当DO反弹后，流加定量的甲醇量，直到发酵结束。 3）起始发酵培养基的甘油浓度为80g/L，过程中不补甘油，诱导后，转速和通气量维持不变，分别流加甲醇浓度为10ml/L的甲醇进行诱导，每当DO反弹后，流加定量的甲醇量，直到发酵结束。 4）根据实验结果和经济效益，确定起始发酵培养基的甘油浓度。 方案二：间歇流加甲醇和指数型流加甲醇对筛选菌种的影响 方案概述：菌体在间歇流加甲醇模式下诱导，使菌体在甲醇瞬间过量的恶劣条件下表达目的产物，从中判断菌种利用甲醇的快慢程度，为指数型流加工艺提供数据优化工艺。 实验方案： 1) 经摇瓶产量较高的菌种分别进行以下工艺试验：起始发酵培养基的甘油浓度由方案一结果确定，过程中不补甘油，诱导后，转速和通气量维持不变，分别流加甲醇浓度为5ml/L、10ml/L和15ml/L的甲醇进行诱导，每当DO反弹后，流加对应的甲醇量，直到发酵结束。 2) 筛选出的高产菌种分别进行以下工艺试验：DO反弹时，限制性流加甘油，达到OD600为150时诱导，通过指数型补料方法来流加甲醇，使菌体的比生长速率分别维持在0.015-h、0.02-h和0.025-h。DO低于下限，则增加转速20rpm和通气量1L/min。 3）根据实验结果，确定指数型流加方式下菌体的最适比生长速率。 方案三 ：DO反馈流加甲醇和指数型流加甲醇对筛选菌种的影响 方案概述：菌体在DO反馈流加模式下进行诱导，当DO适应后，根据工艺要求的DO控制范围，来增加甲醇的流速。根据发酵结果判断菌体利用甲醇的情况，为指数型流加工艺提供数据优化工艺。该补料模式应用历史悠久，早在很多文献上提到。该补料模式操作简单，节省人力。 实验方案： 1）经摇瓶产量较高的菌种分别进行以下工艺试验：①诱导前培养条件不变，诱导 后转速和通气量维持不变，当菌体适应甲醇后通过DO反馈来流加甲醇。DO稳定后，当DO高于20%，每调一次甲