第五章dna体外重组技术-唐旭东-2013级-jian.ppt

概述 1. 质粒的特征 功能： 使宿主细胞具有抵抗不利自身生长因素的能力。 性质：具有不相容性 按拷贝数分类： 严谨性（低拷贝） 松弛型（高拷贝） 分子相对较小，具有较高的拷贝数 含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加。 具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。 抗药基因或营养代谢基因 氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β-内酰胺酶，水解amp β-内酰胺环使amp失效 四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落变为蓝色。 α互补筛选法-（2’37’’） pUC18/pUC19 2. 质粒载体的分类: （2）表达用质粒载体： 除具备载体的必备条件外还应有用于外源基因表达的元件：如启动子、终止子等 分类： 原核表达载体 真核表达载体 （二） ?噬菌体 ?噬菌体作为载体具有两个特点 （三）粘粒载体（cosmid) 质粒序列：复制原点，抗性标志 噬菌体：cos粘端序列 插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍 二、DNA聚合酶 5′→ 3′聚合酶活性 3′→ 5′外切酶活性 5′→ 3′外切酶活性 二、DNA聚合酶 二、DNA聚合酶 三、DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针 四、其他修饰酶 (三) 多聚核苷酸激酶 (四) RNase (五) DNase 四、化学合成法制备基因片段 一、PCR产物的克隆策略 （一）限制性内切酶酶切位点添加法 (二）T/A克隆法 *PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中。 TA克隆方法(一步PCR克隆) （一）粘性末端连接法 （二）平头末端连接法 （三）人工接头法 （四）同聚物接尾法 一、重组DNA分子导入受体细胞转 宿主细胞或受体细胞： 定义：被导入重组DNA分子的细胞。 分类： 原核细胞：大肠杆菌、链霉菌 及枯草杆菌 真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞 要求： ※容易接纳重组DNA分子 ※对载体的复制扩增无严格限制 ※不存在特异的能降解外源DNA的内切酶 ※不对外源DNA进行修饰 重组DNA分子导入方式： 转化(transformation) 将重组DNA分子导入原核细胞的过程。 转染（transfection) 　　将重组DNA分子导入真核细胞的过程。 感染（infection） 　　以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入原核或真核细胞，使目的基因得以繁殖的过程。 转化(transformation) 转化的关键：感受态细胞的制备 感受态细胞（competent cell）：经理化方法处理而容易接收外源DNA分子的细胞。 转化的方法： 　化学法（ CaCl2 法）：需感受态细胞 　电穿孔法：不需感受态细胞 　　　　　　转化效率较高 　　　　　　但需特殊仪器 基因导入装置(Bio-Rad) 　　　　　转染（transfection) 　　分类：瞬时转染 稳定转染：G418（Geneticin) 插入失活筛选法(1’20’’) （四）序列分析 PE 3700型DNA测序仪 菌落印迹杂交 (6’03’’) SDSpurified recombinant human CK2 β subunit and Western blot 第六节 外源基因的表达 一、外源基因在原核系统中的表达 大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用 ※表达载体：选择标志、多克隆位点 强启动序列、翻译调控序列 ※优点： 培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产。 原核表达系统的不足 只适合表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA 表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行修饰 真核蛋白常以无生物活性的包涵体形式存在 难以实现大量表达分泌性蛋白 真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解 原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素 二、外源基因在真核细胞中的表达 真核表达系统是指在真核细胞中表达外源基因的体系。 主要有：酵母、哺乳动物、昆虫细胞（杆状病毒）系统和高等植物系统 （一）真核表达系统的优缺点 优点： 可表达克隆的cDNA或真核基因组DNA 可进行糖基化、磷酸化、乙