第五章-体外分析技术.ppt

RIA 小 结 灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便 第二节 免疫放射分析法 *Ab + Ag-*Ab + *Ab （immunoradiometric assay,IRMA） B% Ag （B） （F） 在体外, 利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。 IRMA与RIA工作原理的主要区别 RIA IRMA 竞争性抗原抗体结合反应 非竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗原 采用标记抗体 三种主要反应试剂 二种主要反应试剂 所用抗体是限量的 所用抗体是过量的 *AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关 反应到达平衡慢 反应到达平衡快 非特异结合主要影响高剂量区 非特异结合主要影响低剂量区 低剂量区有不确定因素 低剂量区无不确定因素 B% B% 拟合的标准曲线 拟合的NSB 拟合的标准曲线 拟合的NSB IRMA的标准曲线及非特异结合曲线 RIA的标准曲线及非特异结合曲线 IRMA和RIA低剂量区的不确定因素示意图 RIA + + 或 0 1 IRMA + 1 非放射性标记免疫分析技术 酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术 一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。 ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。 常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。 二、化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。 1.化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。 2.化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物--金刚烷，使底物发射出光子。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。 3.电化学发光免疫分析(略) 4.生物发光免疫分析(略) 三、时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） 时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属—镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种 : 钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（Te） 镧系元素荧光重要特点： 1. 极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns 2. 200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3. 狭窄的发射峰 4. 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） 一、基本原理 镧系元素（15）：铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy），鋱（Te） Eu + Eu Eu + 增强液 + Eu “解离增强镧系荧光免疫分析” 时间分辨荧光检测的基本原理示意图 荧光衰退时间 铕：730000 ns 钐：50000 ns 一般荧光物质：10 ns 铕的荧光 * 体外分析技术 * 定义 以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 * 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析 10 -12 10 -9 10 -6 10 -3 10 -0 pg/mL ng/mL mg/mL mg/mL g/L 免疫分析 Therapeutic Drugs Thyroid