第五章重组DNA技术讲课.ppt
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* 第五章 重组DNA技术 以LNX1基因的表达载体构建进行说明 第 一 节 重组DNA技术的主要工具 一 限制性核酸内切酶 定义 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ (基因工程技术中常用Ⅱ型) Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 :平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 重组DNA技术中常用的工具酶 切除末端磷酸基 碱性磷酸酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 末端转移酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化,或标记探针 多聚核苷酸激酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补,标记或DNA序列分析 反转录酶 又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性,而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成,双链DNA 3?末端标记等 Klenow片段 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 DNA聚合酶Ⅰ 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键,使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA连接酶 用于PCR Taq酶 功 能 工 具 酶 第 二 节 载体 载体定义 为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 含有能被宿主细胞基因表达系统识别的表达元件、从而可以在宿主细胞内表达目的基因合成目的蛋白的载体。 载体的选择标准 复制的起始点,能自主复制; 选择标记,具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定; 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点; 分子量小,以容纳较大的外源DNA。 表达载体还要有表达元件。 质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 第 二 节 重组DNA技术的基本原理 基本原理 获取目的基因,选择载体 DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 切割目的基因和载体 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 一 目的基因的获取 1.基因组DNA文库(genomic DNA library) 2. cDNA文库(cDNA library) 3.聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 4.化学合成法 要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 三 目的基因与载体的连接 二 克隆载体的选择和构建 1. 平端连接 适用于:限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 2. 粘性末端连接 方式:(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 单酶切末端连接 双酶切末端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 同一限制酶切位点连接 重组体 载体自连 目的基因自连 目 录 不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机
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