SN_T 2969-2011国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测方法 RT-PCR法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2969--2011国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的RT-PCR 法检测方法Detecting method for eastern equine encephalitis virus in mosquitoesat frontier partRT-PCR method2011-05-31 发布2011-12-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测方法　RT-PCR 法SN/T 2969—2011*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230　1/16　印张 0.55字数 ９千字2011年11月第一版　2011年11月第一次印刷印数 11600*书号：155066·2-22668 SN/T 2969—2011前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人：薛芳、孙时、耿丽梅、田虹、宋锋林、张晓龙、高玉峰、孙立新、吴忠华、郭天宇。 SN/T 2969-—2011国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测方法　RT-PCR 法1范围本标准规定了国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测对象、生物安全要求、样品的保存运输、检测方法和结果判断。本标准适用于国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部，2006年）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 eastern equine encephalitis virus; EEEV东部马脑炎病毒东部马脑炎病毒属披膜病毒科甲病毒属，病毒粒子呈圆形，核衣壳呈20 面体对称，直径 50 nm～70 nm,含有一个高电子密度的核心，是引起人类东部马脑炎的病原体。黑尾赛蚊(Culiseta melanura）、盐泽伊蚊（Aedes sollicitans）等蚊虫为本病毒的主要传播媒介。4检测对象出人境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。5生物安全要求实验室生物安全要求按照GB19489及《人间传染的病原微生物名录》的规定执行。6器材与试剂6.1器材液氮罐、冷藏箱、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、PCR扩增仪、烘箱、水浴锅、生物安全柜、匀浆器、移液器、PCR反应管、冻存管、离心管、塑料平Ⅲ、镊子等。1 SN/T 2969—20116.2 试剂Trizol、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC)、引物、缓冲液、混合酶、RNA酶抑制剂等。7样品的保存运输7.1样品的分栋、分装将捕获的蚊虫现场用二氯甲烷熏杀后，快速分栋。若条件允许，分栋过程应在简易低温装置上进行。分抹后按类别装入适当的容器(如：冻存管、离心管、塑料平m等），加贴标签标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。7.2样品的保存运输（物理法）分装完毕的样品，尽快装人液氮罐、冷藏箱或其他适当的冷冻（冷藏)装置，尽早送实验室处理。若采样点与实验室相距较近，也可将活体释品连同采样工具直接送实验室处理。运送过程中防止蚊虫逃逸。7.3样品的保存运输（化学法）在装有蚊虫的密闭容器内加入5倍体积的RNA保护剂，常温下5d内送达实验室。8样品的检测8.1核酸(RNA)提取8.1.1　RNA 提取方法使用Trizol试剂提取总RNA。可参照如下方法提总RNA，或便用可达到同等效果的RNA提取试剂盒：取蚊虫个体(单只或多点)放人 1.5 mL离心管内,胍人1 mLj Trizol 试剂后研磨成匀浆,室温放置 5 min。加人200 μL二氯甲烷，剧烈振荡15 s，窑温放置3 min,于4℃12000g离心15min。小心吸出上清液，置于另一1.5~mL离心管中，加大异丙醇500μL，室温放置10min，4℃12 000g离心 10 min。弃上清液,加人75%乙醇1 mL洗涤,4℃ 7500g离心5min。弃上清液，将沉淀自然干燥，加人适量的DEPC水溶解沉淀。一70℃冻存提取的 RNA或直接用于反转录实验。8.1.2注意事项RNA提取过程中注意事项如下：a）RNA的