SN_T 3742-2013国境口岸西尼罗病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3742---2013国境口岸西尼罗病毒检测方法实时荧光 RT-PCR 法Detection method for West Nile Virus at frontier ports-Real-time fluorescence RT-PCR2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3742--2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国腾冲出人境检验检疫局本标准主要起草人：胡孔新、杨鹏飞、侯中生、史蕾、张丽萍、徐焕洲、孙肖红、杨宇、刘丽娟、王静。I SN/T 3742—2013国境口岸西尼罗病毒检测方法实时荧光 RT-PCR 法1 范围本标准规定了国境口西尼罗病毒感染疑似病例或蚊携带西尼罗病毒核酸实时荧光 RT-PCR检测方法，包括标本采集、保存及转运、样本处理~检测方法结果判定及报告。本标准适用于国境口西尼罗病毒感染疑似病例或蚊携带西尼罗病毒的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室‧生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1西尼罗病毒‧West Nile Virus属于黄病毒科（Flaviviridae)黄病毒属（Flauivirus）单股正链RNA病毒，具有黄病毒成员的典型特征，病毒颗粒为直径约40 nm～60.nm的球型，约25nm的核衣壳外包裹着脂质双分子膜。WNV是全球广泛流行的一种病毒，蚊虫是最主要的传播媒介，鸟是该病的贮存宿主，也是 WNV感染的主要传染源，病毒可在鸟体内大量繁殖并形成高带毒量的病毒血症，主要引起人和哺乳动物的西尼罗热和西尼罗脑炎。4检测对象国境口岸西尼罗病毒感染疑似病例或截获的蚊虫。5实验室生物安全要求5.1检测工作中的个人防护遵照GB19489。5.2生物安全应遵照GB19489和WS233对生物安全2级(BSL-2)实验室的生物安全要求。5.3使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。1 SN/T 3742-—20136仪器设备与试剂6.1仪器设备常用仪器设备如下：超净工作台；二级生物安全柜；微型混合器、涡旋振荡器；—超低温冰箱（一70℃及以下）;一普通台式离心机；高速冷冻离心机（离心力可达20000g）；可调式微量加样器（10uI、100μl、1000 μl）及配套带滤芯吸头；-荧光 PCR检测仪（如:LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000 型等）。6.2试剂常用试剂如下：商品化系统如 BD Universal Viral CulturetteTM Transport System;Ag-Path-IDTM one-step RT-PCR 试剂盒。1)7样本采集、保存与转运7.1样本采集7.1.1人血清样本：采集疑似病例的静脉血 3 mL～5 ml,室温静置 30 min使其凝固,然后1500 r/min～2 000 r/min离心10 min，去除纤维蛋白和红血球，收集血清于2 ml无菌螺口塑料管中。7.1.2蚊样本：根据实际工作需要采集蚊虫样本，按1～5只或适量为~组，装人2ml.螺口翘料管内。7.2样本的保存采集的人血清样本或分类分组后的蚊虫样本，装人螺口塑料血清管，用耐低温油性记号笔记上编号，于70℃以下保存待检。7.3样本转运疑似人感染西尼罗病毒感染材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令。8样本处理8.1疑似病例血清样本无需处理可直接提取核酸进行检测，如不能及时检测应存放在一70℃以下冰箱。1)[由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 3742—20138.2蚊虫样本在冰上操作。取出蚊样本，倒人研磨器中,加人1 mL标本处理液，反复研磨至匀浆，置于 4℃预冷的离心机上，12 000 r/min离心10 min。取上清液进行核酸提取，剩余的蚊标本研磨液需保存在一70 ℃ 以下以备复查。9样本检测方法9.1样本的核酸提取9.1.1样本核酸提取采用QIAamp Viral RNA Kit病毒RNA提取试剂盒进行²’