SN_T 4055-2014贝类中诺如病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4055--2014代替 SN/T 1635--2005贝类中诺如病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法Detection method of norovirus in shellfish-Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR2014-11-19 发布2015-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局创 SN/T言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1635-2005《贝类中诺沃克病毒检测方法　普通RT-PCR方法和实时荧光RTPCR方法》。本标准与 SN/T 1635--2005 相比，主要技术变化如下：修改了标准的中文名称；修改了病毒名称，即由诺沃克病毒修改为诺如病毒。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广西出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘军义、潘良文、李想、吕蓉、韦梅良、陈立军、罗兆飞本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1635-2005。 SN/T 4055—2014贝类中诺如病毒检测方法普通 RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法1范围本标准规定了贝类中诺如病毒普通 RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类中诺如病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 19495.2¥转基因产品检测实验室技术要求3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光 RT-PCRreal-time fluorescence RT-PCR实时荧光 RT-PCR方法是在常规 RT-PCR 的基础上，加人了一条特异性的荧光探针。该探针为-寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq 酶的 5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4 试剂所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。4.1诺如病毒阳性标本：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。一80℃低温冰箱保存。4.2甘氨酸缓冲液：见A.1.1。4.3 PEG 8000 溶液:见 A.1.2。4.4550XTAE缓冲液:见 A.1.3。4.5溴化乙锭溶液（10 μg/μL）：见 A.1.4。4.6含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶：见A.1.5。4.710×加样缓冲液：见A.1.6。1 SN/T 4055—20144.8裂解液：Tri-reagent(Sigma 公司,Cat.No.T-9424)或其他等效裂解液。4.9 Poly(dT)磁珠: Dynabeads-oligo(dT)2s (Cat. No. 61005,Dynal Biotech Inc.,Oslo, Norway)或等效品。4.10无RNase超纯水：见A.2.3。4.1175%乙醇:见A.2.4。4.12异丙醇：未开封的新品。4.131XRNA吸附缓冲液：见 A.2.5。4.142×RNA吸附缓冲液:见 A.2.6。4.15洗液:见 A.2.7。4.16RNase 抑制剂。4.17逆转录酶 AMV。4.18DNA聚合酶。4.19dNTPs:含 dATP、dUTP、dCTP、dGTP 各 10 mmol/L.4.20引物和探针：根据表1和表2的序列进行合成引物和探针，加无RNase超纯水配制成50μmol/L储存液。表1普通 RT-PCR检测的引物引检测的病毒类群物扩增片断大小/bp正义引物JV12:5-ATACCACTATGATGCAGATTA-3GI 和 GII327反义引物JV13:5′-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3表 2实时荧光 RT-PCR检测的引物和探针检测的病毒类群引物和探针序列扩增片断大小/bp正义引物 COG1F:5′-CGYTGGATGCGNTTYCATGA-3反义引物 COG1R:5’-CTTAGACGCCATCATCATTYAC-3*GI107探针 RING1(a)-TP:5-FAM-AGATYGCGATCYCCTGTCCA-TAMRA-3探针 RING1(b)-TP:5-F