DB45T 2138-2020 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光RT-PCR 法.pdf

ICS11.020

C51

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB45/T2138—2020

水体中诺如病毒的核酸检测方法

实时荧光RT-PCR法

Detectionofnorovirusnucleotideacidinwater—Real-timeRT-PCR

2020-07-24发布2020-08-20实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

DB45/T2138—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由广西壮族自治区卫生健康委员会提出并宣贯。

本标准由广西壮族自治区卫生技术标准委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：刘巍、邓丽丽、谭冬梅、马宇燕、钟革、李秀桂。

Ⅰ

水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光RT-PCR法

1范围

本标准规定了水体中诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。

本标准适用于广西区域内地表水、地下水、集中式供水、娱乐用水、污水等水体中基因Ⅰ组和基因

Ⅱ组诺如病毒的检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

诺如病毒Norovirus

世界范围内引起急性胃肠炎暴发和散发的重要病原体。大多数诺如病毒引起的水源性暴发疫情是由

于饮用水或生活用水被污染所致。诺如病毒属于人类杯状病毒科的诺如病毒属，是一组形态相似、抗原

性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径26nm～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺

如病毒基因组是单股正链RNA，全长7.5kb～7.7kb，根据基因特征，诺如病毒被分为6个基因组

（genogroup，GⅠ~GⅣ),GⅠ和GⅡ是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因组，GⅣ也可感染人，

但很少被检出。

2.2

实时荧光逆转录-聚合酶链式反应Real-timeRT-PCR

在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值对模

板进行定性。

2.3

Ct值Cyclethresholdvalue

每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的Ct值与该模板的起始拷贝

数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。

3原理

水样在通过带负离子混合纤维素膜时，带正离子的病毒被吸附到膜上，然后再洗脱病毒，并用聚乙

二醇沉淀病毒达到富集浓缩的效果。应用实时荧光RT-PCR技术，针对诺如病毒衣壳蛋白区N/S区设计特

异性引物和探针，荧光探针的5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭荧光基团，当探针完整时，报告

荧光基团的发射波长被淬灭荧光基团的激发波长吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5’→3’端外切酶活性将

探针酶切水解，报告荧光不再受淬灭荧光的影响，使荧光监测系统收集到报告基团的荧光信号，即每扩

增一条DNA链，可产生一个报告基团的荧光信号，实现荧光信号积累与PCR产物形成同步。

4试剂和耗材

4.1试剂

4.1.1除另有说明外，本文件所使用的试剂均为分析纯，分子生物学试剂所用水为无RNA酶的水。

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DB45/T20382020

4.1.22.5mol/L氯化镁（MgCl2）溶液，配制遵照附录A中的A.1执行。

4.1.33％牛肉浸膏洗脱液，配制遵照附录A中的A.2执行。

4.1.416％PEG8000溶液，配制遵照附录A中的A.3执行。

4.1.50.2mol/L的Na