脂肪酶综述完整版本.ppt

脂肪酶研究概况概述脂肪酶的来源产脂肪酶微生物的筛选脂肪酶的生产脂肪酶酶活性脂肪酶催化性能改良固定化脂肪酶脂肪酶应用一、脂肪酶的概述脂肪酶(triacylglycerollipaseEC3.1.1.3)广泛的存在于动植物和微生物,它可将脂肪分解成甘油和脂肪酸,是一类特殊的酯键水解酶。脂肪酶的结构特点同源区段:His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(X、Y、W、Z是可变的氨基酸残基);活性中心是丝氨酸残基,正常情况下受1个α-螺旋盖保护。脂肪酶的特性位置专一性是指酶对底物甘油三酯Sn-1(或3)和Sn-2酯键的识别和水解。立体专一性一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的1位和3位酯键识别和选择性水解。如猪胰脂肪酶水解甘油三酯时没有1和3位立体选择性;人奶和牛奶中脂蛋白脂肪酶优先水解1位酯键。二、脂肪酶的来源脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中而微生物脂肪酶种类最多,广泛存在于细菌、酵母和霉菌中,最易获得和大规模生产,且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性,因此是工业用脂肪酶的重要来源。细菌脂肪酶细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵,生产比较容易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶,且在pH4~11、温度30℃~60℃间具有良好的稳定性。假单胞菌属的细菌脂肪酶应用最为广泛。真菌脂肪酶真菌脂肪酶具有温度和pH稳定性、底物特异性以及在有机溶剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅速。商业化的真菌脂肪酶主要有:黑曲霉(Aspergillus-niger),米曲霉(ThermomycesLanuginosus)等。三、产脂肪酶微生物的筛选可养微生物脂肪酶高产菌筛选通常采用含甘油三酯琼脂平板法,并通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维多亚蓝等作为筛选标记。施巧琴(1981)采用脂肪酶水解脂肪后产生的脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝绿色透明圈平板法筛选出产碱性脂肪酶的扩展青霉。不可养微生物脂肪酶产生菌的筛选宏基因组(metagenome)技术绕过纯培养步骤，直接从生境样品中获取遗传信息，提供更加全面的基因资源，从而有效地提高了新酶的筛选效率。采用宏基因组技术筛选脂肪酶有两种途径-功能筛选和序列筛选。功能筛选途径即把来源于不可培养微生物的DNA克隆到大肠杆菌质粒中，构建宏基因组文库，然后基于脂肪酶活性筛选获得微生物脂肪酶基因。序列筛选途径以脂肪酶三联体活性中心(Ser-Asp-His)和氧阴离子(oxyanionhole)区的保守序列设计引物，以环境基因组DNA为模板，扩增脂肪酶基因片段，然后用基因组步查(genomic-walking)的方法克隆出全长脂肪酶基因。Bell等用基于序列筛选途径从新西兰KairuaPark温泉环境基因组中克隆到一种新脂肪酶基因，并在异源宿主大肠杆菌中实现表达。四、脂肪酶的生产培养基及发酵条件优化影响发酵过程的因素：培养基组成、接种量、种龄、培养温度、转速、装液量、发酵周期、溶氧、pH值和通气条件。条件优化：单因子法、正交设计法培养方式与发酵调控采用液体深层培养法生产，补料分批发酵。补料优化策略：通常以基质的补料速率为主控制量,溶氧、pH、细胞浓度(x)、底物浓度(s)、比生长速率(μ)、摄氧(OUR)、氧传递速率(OTR)、CO2生成速率(CER)和呼吸商(RQ)等变量为辅助控制量,求取优化控制使得发酵终止时产物产量最高。发酵培养基由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成。速效碳源如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。一般认为复合氮源对微生物生长及产酶效果较好。有机氮源一般比无机氮源要好。钙离子和镁离子能促进脂肪酶的分泌。大多数微生物只有诱导物存在时才能产生脂肪酶。诱导物可以是甘油三酯、长链脂肪酸、脂肪酸酯及其表面活性剂。许多研究表明培养基中添加表面活性剂如Tween80、TritonX-100、SDS、PEG和阿拉伯胶等可以不同程度地提高脂肪酶的产量。五、脂肪酶催化性能的改良从催化特性来看,脂肪酶的另一显著特点是它只能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中,脂肪酶通常催化水解反应的进行,而在有机相中,它却能催化各种合成反应:如酯化、酯的醇解、酯的氨解和酯的