细胞融合杂交瘤细胞克隆单克隆抗体制备.docx

阳性杂交瘤细胞的制备1）瘤细胞培养骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长，如附着性生长的细胞多时，用吸管轻轻吹打或轻轻叩击培养容器即可分离下来。通常要维持细胞于指数生长期（细胞培养时间为 15~20 小时），每 3~5 天取细胞 0.2~1ml 移入到 10ml 新培养液中，其最大细胞密度不能超过 5×10 10 /ml。一般使用含有高糖的 DMEM 培养液，并补加有 pH 的稳定剂 HEPES。髓瘤细胞的准备?? 融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：a、 于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。b、 融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。c、 1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。d、 加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。e、 取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系：名称来源耐受药物Ig链???H LP3/X63-Ag8(X63)BALB/C骨髓瘤MOPC-218-氮鸟嘌呤r1 　KP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤－－P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤－ K（不分泌型）P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤8-氮鸟嘌呤－－SP2/0-Ag14(SP2/0)（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤8-氮鸟嘌呤－－F0BALB/C骨髓瘤8-氮鸟嘌呤－－S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脱氧尿嘧啶核苷－－MPC11-45.6TG1.7BALB/C骨髓瘤MPC-116-巯鸟嘌呤r2b 　K210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鸟嘌呤－　 KGM15006TG-A12人骨髓瘤GM15006-巯鸟嘌呤r1 　KU-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鸟嘌呤ε　　λ2.1）脾细胞的制备（方法一）1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。2．无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用 5ml 无血清培养液冲洗一次。3．将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中。4．在脾中部切开一小口用注射器向脾脏内注入 3 ml 无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液。5．把细胞悬液注入 50ml 离心管中，加 10~20ml 培养液，轻轻吹打数次，室温中置 5 分钟。6．离心（800~1000 转/分）计数，备用。2.2）脾细胞的制备（方法二）取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏（也可用注射器内芯挤压脾脏），使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞。3）饲细胞的制备：常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。方法一：1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。2．切开