杂交瘤技术制备单克隆抗体.docx

杂交瘤技术制备单克隆抗体 来源： 　　1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 　　免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 项目常规免疫血清抗体McAb抗体产生细胞多克隆性单克隆性抗体的结合力特异性识别多种抗原决定簇特异性识别单一抗原决定簇免疫球蛋白类别及亚类不均一性，质地混杂同一类属，质地纯一特异性与亲合力批与批之间不同特异性高，抗体均一有效抗体含量0.01～0.1mg/ml（小鼠腹水）0.5～5.0mg/ml(小鼠腹水) 0.5～10.0μg/ml（培养物上清液）用于常规免疫学实验可用单抗组合应用抗原抗体形成格子结构（沉淀反应）容易形成一般难形成抗原抗体反应抗体混杂，形成2分子反应困难，不可逆可形成2分子反应，可逆单克隆抗体制备的一般流程如下: 时间（天）制备步骤说明1初次免疫每种抗原免疫5只Balb/c小鼠，抗原与弗氏完全佐剂22第二次免疫抗原与弗氏不完全佐剂43第三次免疫抗原与弗氏不完全佐剂免疫一周后取血+ELISA检测效价57加强免疫单独抗原三天后采血（血清做阳性对照），取脾60细胞融合SP2/0骨髓瘤细胞与一只小鼠（ELISA效价较高）的脾细胞融合70-100HAT选择杂交瘤细胞ELISA效价检测筛选阳性细胞克隆杂交瘤细胞的亚克隆进行2-4次杂交瘤细胞的亚克隆，直至细胞上清的ELISA结果阳性率达到100%，将完成细胞建株115-120亚类鉴定对杂交瘤细胞株所分泌的抗体进行亚类测定120冻存细胞株每种抗原制备至少2株杂交瘤细胞121-140制备腹水并纯化接种细胞制备腹水、Protein A/G纯化　　单克隆抗体的制备方法如下。 　　（一）动物的选择与免疫 　　1．动物的选择 　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 　　（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） 　　↓3周后 　　第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） 　　↓3周后 　　第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） 　　↓2～3周 　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） 　　↓3天后 　　取脾融合 　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 　　（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 　　初次免疫 1×107/0.5ml ip 　　↓2～3周后 　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip 　　↓3周后 　　加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv 　　↓ 　　取脾融合 　　 （二）细胞融合 　　1．细胞融合前准备 　　（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。 表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系 　　 名