淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术.doc

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 　　一、细胞融合前准备 　　(一)　免疫方案 McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) 2～3周后 1×10７／0.5ml ip 3周后 (融合前三天)　110７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) 　　　　　　　　　　取脾融合 　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射 (一般0.8～1ml　0.2ml／点) 3周后 ip 　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml) 3周后 ip 　　　　　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) 2～3周后 50～500μg为宜，ip或iv 3天后 　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二)　饲养细胞 (较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 　　　　　小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 　　　　　拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 　　　　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 　　　　　　↓ 　　　　　用无菌注射器注入6～8ml培养液 　　　　　反复冲洗，吸出冲洗液 　　　　　　↓ 　　　　　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟 　　　　　用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数110５／ml 　　　　　加入96孔板，100μl／孔 　　　　　放入37℃　CO2 　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1105／ml，均为100μl／孔。 (三)　骨髓瘤细胞 McAb。 NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。 RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。 95％，也是决定细胞融合的关键。 (四)　免疫脾细胞 B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。 10８左右。 　　(一)　细胞融合流程 (1)　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。 (2)　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 (3)　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。 (4)　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。 (5)　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。 (6)　在室温下融合: 30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。 90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。 PEG作用，每隔２1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。 (7)　离心，800rpm，6分钟。 (8)　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使