核酸外切内切酶聚合酶连接酶.doc

核酸外切酶（exonuclease） 　 　 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化HYPERLINK /view/19501.htm水解3、5-HYPERLINK /view/82140.htm磷酸二酯键，降解HYPERLINK /view/117213.htm核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。 　　 单链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）和核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）能够从5′-末端或3′-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性HYPERLINK /view/1326.htm酶，是一种耐受性很强的核酸酶。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子。 　　 双链的核酸外切酶包括HYPERLINK /view/29729.htm大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）、HYPERLINK /view/302664.htmλ噬菌体核酸外切酶（λexo）以及T7HYPERLINK /view/43444.htm噬菌体基因6核酸外切酶等。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）具有多种HYPERLINK /view/817614.htm催化功能，可以降解双链DNA分子中的许多类型的磷酸二酯键。其中主要的催化活性是催化双链DNA按3′→5′的方向从3′-OH末端释放5′-单核苷酸。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）通过其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA再配合使用Klenow酶，同时加进带HYPERLINK /view/357582.htm放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。 　　 λ噬菌体核酸外切酶（λexo）最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子从5′-P末端进行逐步的水解释放出5′-单核苷酸。但不能降解5′-OH末端。 内切酶（incision enzyme） 这是一类能从DNA分子中间水解HYPERLINK /view/82140.htm磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase）,它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序识别顺序 内切酶主要分成三大类。 　　 第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 　　 第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。如果识别位置在DNA分子中分布是随机的，则识别4个核苷酸的限制性内切酶每隔46（4096）个核苷酸就有一个切点。人的单倍体基因组据估计为3×199核苷酸，识别4个核苷酸的限制性内切酶的切点将有（3×109/2.5×102）约107个切点，也就是可被这种酶切成107片段，识别6个核苷酸的限制性内切酶也将有（3×109/4×103）约106个切点。 第三类内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 粘性末端的意义： 连接便利： 不同的DNA双链，只要粘性末端碱基互补就可以连接，这比连接两个平齐末端容易的多；同一个DNA分子内连接，通过两个相同的粘性末端可以连接成环状分子。 （2）5’末端标记： 凸出的5’末端可以用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等）造成人工粘性末端 （3）补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端 如EcoRI的识别顺序为： 　　 ↓ | 　　 5’……GAA | TTC……3’ 　　 3’……CTT | AAG……5’ 　　 | ↑ 　　 垂直虚