T4DNA连接酶#EL0011Thermoscientific.doc

T4 DNA Ligase ——Thermo scientific #EL0011 产品信息 特点快速 – 室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。 该酶在Fermentas公司限制酶、PCR和RT缓冲液(添加ATP)中活性。 配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。 应用克隆酶切产生的DNA片段。 克隆PCR产物。 连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。 定点诱变。 扩增片段长度多态性 (AFLP)。 连接酶介导的 RNA 检测 (3)。 双链DNA，RNA 或 DNA/RNA 复合体中缺口的修复。 线性 DNA自身环化。 说明 T4? DNA Ligase催化双链DNA或RNA中毗邻的5’ -磷酸基团和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键。酶还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性 (1, 2)。 T4 DNA Ligase需要辅因子ATP。 浓度 1 Weiss u/μl = 200 CEU*/μl5 Weiss u/μl = 1000 CEU*/μl30 Weiss u/μl = 6000 CEU*/μl* 一个粘性末端连接单位的是指在16°C 、30分钟内50%连接HindIII酶切的lamda DNA产物所需要的酶的量。 来源 含有T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌。 分子量 55.3 kDa，单体。 活性单位定义 1个活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，37°C、20分钟内将1nmol [32PPi]转换为Norit可吸收形式所需的酶量(Weiss单位**(4)。 酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3?μM [32PPi]. ** 1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。1个粘性末端连接单位：20? μl反应体系(50 mM Tris-HCl?(pH?7.5), 10 mM燤gCl2, 10 mM燚TT, 1 mM ATP, 25 μg/ml燘SA, 0.12 μM (300?μg/ml)的5’-DNA末 端)中， 在16°C、30分钟内50%连接HindIII酶切的Lambda DNA产物所需要的酶量。 保存缓冲液 保存缓冲液组分：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA和50% (v/v)甘油。 10X T4 DNA Ligase 缓冲液(#B69) 400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25°C)。 质量控制 相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能检测：粘性末端或平末端DNA的连接能力。 抑制与失活 抑制剂：当反应体系中NaCl或KCl的浓度超过200? mM时，可强烈抑制T4 DNA Ligase活性。 失活：65°C加热10分钟或者70°C加热5分钟。 备注 聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率 (5) 。反应体系中的PEG 4000的建议浓度为5% (w/v)。 T4 DNA Ligase与DNA结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率。为避免此现象，电泳前需处理样本或分子量标准。样本处理方法如下：样本或分子量标准与Fermentas公司6X DNA Loading Dye SDS溶液(#R1151)混合；70°C加热5分钟或65°C加热10分钟后冰浴保存。 转化时，连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的10%。 电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的T4 DNA Ligase。然后经乙醇沉淀纯化抽提产物。 DNA插入片段与载体DNA连接 反应体系配方如下： 组分 粘性末端连接 平末端连接 线性载体DNA 20-100 ng 插入片段 DNA 与载体的摩尔比为1:1到5:1 10X T4 DNA Ligase buffer 2 μl 50% PEG 4000 溶液* - 2 μl T4 DNA Ligase 0.2 μl (1 u) 1 μl (5 u) 水，无核酸酶 (#R0581) 至 20 μl 总体积 20 μl 20 μl  * 50% PEG 4000溶液随Fermentas T4 DNA Ligase配套提供(#EL0335，#EL0334)。 粘性末端：22°C孵育10分钟；平末端：22°C孵育1小时。 65°C热失活10分钟。 转化：每50 μl化学感受态细胞使用5 μl连接产物；每50 μl电转感受态细胞使用1-2 μl连接产物。 备注 ：如需增加转