《第六章酶、细胞、原生质体固定化-公开课》-课件.ppt

2、对反应pH值的影响 (三)固定化对酶反应性能的影响 大多数固定化酶的最适反应温度与游离酶差不多，少数有提高的，个别有下降的。 1、固定化酶对酶反应温度的影响 (1) 载+，酸移； （2) 载-，碱移； （3) 载不带电荷，最适pH值一般不变。 受载体性质等的影响，酶固定化之后，反应最适pH往往有所偏移，最适pH值变高，谓之“碱移”，最适pH值变低，谓之“酸移”。 偏低（酸移） 吸引OH-，pH↑ 载体（＋） 一般不变 载体不带电荷 偏高（碱移） 吸引H＋，pH↓ 载体（-） 最适pH 微环境 偏低（酸移） pH↑ 产物（碱性） 一般不变 产物（中性） 偏高（碱移） pH↓ 产物（酸性） 最适pH 微环境 反应的最适pH (1) 载体性质 (2)产物性质 催化大分子底物的酶，如淀粉酶、蛋白酶等固定化后，由于载体的存在，使得底物不易接触到酶，降低酶的催化活力； 对既作用于大分子底物，又可作用与小分子底物的固定化酶，底物特异性往往会发生改变。 若载体和底物都是带电荷的，当它们带同种电荷时，将使酶反应活性降低；反之，若带相反电荷，则可能增强反应活性。 3、固定化对底物选择性的影响 固定化酶的立体障碍示意 Vm不变；米氏常数Km增大。 疏水性载体固定化的酶，作用的底物如果也是疏水性的，常引起Km值变小。 4、固定化对酶促反应Km和Vm的影响 四 固定化酶的应用 （一）在工业生产上的应用 乙酰-DL—Ala L—Ala +乙酸+ 乙酰-D—Ala 1、氨基酰化酶 世界上第一种用于工业化生产的固定化酶。 泵 储 罐 反应产物 离心机 消旋反应器 固定化酶柱子 晶体 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 2、葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。 1、消血栓 纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。 酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。 2、人工肾 原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。 （二）固定化酶在医学上的应用 1、酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。 优点： ①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度； ②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。 （三）在分析检测中的应用 1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。 葡萄糖氧化酶电极 D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸＋H2O2 根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。 酶电极示意图 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶、过氧化物酶与还原型邻联甲苯胺一起用明胶固定在滤纸条上可制成酶试纸。 氧化型邻联甲苯胺 葡萄糖+O2 葡萄糖酸+H2O2 H2O2 H2O+[O] [O]+还原型邻联甲苯胺 葡萄糖氧化酶 过氧化氢酶 （无色） （蓝色） 此酶试纸已在临床中用以测定血液或尿液中葡萄糖含量，从而诊断疾病。 （1）酶传感器的原理 生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。 生物识别元件(Biological recognition element) 是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。 换能器(Transducer) 将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。 酶传感器工作原理示意图 酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应； 变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。? （2）酶传感器的应用 水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物。 水质监测 德国研发的环境废水BOD分析仪 葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。 医疗方面 * 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室 * 第六章 酶