酶工程 第五章 酶、细胞、原生质体固定化.ppt

凝胶孔径应小于酶分子直径，因而不适用于大分子底物或大分子产物的酶类的固定化 将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。 它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。同时，小分子底物能通过膜与酶作用，小分子产物经扩散而输出。 2. 半透膜包埋法 (microencapsulation) 乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。 表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。 1 清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体。 微囊 酶液滴 例：尼龙膜界面聚合包埋 酶+己二胺(水) +庚二酰氯 (氯仿) 混合?  乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合 形成包埋酶的尼龙膜珠粒 Tween 20破乳化，得到微囊包埋酶 原理：在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。 表面活性剂(surfactant)：具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。 该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。 表面活性剂乳化液膜法： 缺点：反应条件要求高，制备成本也较高。 微囊直径几微米～几百微米，比表面积大，物质交换迅速 低分子底物可以自由通过并进入微囊内，与酶反应后的生成物被排除在微囊外 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内 优点: 将酶包埋于脂质体(Liposome)中 脂质体：具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。 特点： 具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。 3. 脂质体（Liposome）包埋法 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比： 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。 用 微胶囊 固定化方法 吸附法 包埋法 共价结合法 交联法 物理吸附法 离子吸附法 制备难易 易 易 较难 难 较难 结合程度 弱 中等 强 强 强 活力回收 高，酶易流失 高 高 低 中等 再生 可能 可能 不能 不能 不能 费用 低 低 低 高 中等 底物专一性 不变 不变 不变 可变 可变 各种固定化方法的优缺点比较 二、固定化酶的性质 影响酶催化活性的因素： 1. 构象改变和立体屏蔽 2. 分配效应和扩散限制效应 （1）酶的活力 一般下降 解决办法：考虑相应的固定化过程可能对酶的影响，避免损害酶的活性中心，有时在固定化反应体系中会加入抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心。 例：乳糖酶的固定化就采用在其抑制剂葡萄糖-?-内酯存在下进行聚丙烯酰胺凝胶的包埋，如此可获得高活力的固定化乳糖酶。 （2）酶的稳定性 一般提高 原因： ①固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形。 ②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度 A固定化酶 B游离酶 如：氨基酰化酶，70℃，15分钟，酶失去活性。 而固定化后， 70℃，15分钟，有80%活性。 对蛋白酶水解作用稳定性增强 对变性剂作用的稳定性提高 保藏稳定性和操作稳定性提高 天然胰凝乳蛋白酶在pH 4.1，4℃保存4个月，残留活力仅为原活力的2%。偶联于琼脂糖后，在同样条件下，却可保存82%的活力，有利于运输、贮存和重复使用。 （3）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关：多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。 例：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5～10℃；以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高5～15℃。 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。 如：氨基酰化酶 用DEAE—葡聚糖凝胶经离子键结合法固定化后，其最适温度(72℃)比游离酶的最适温度(60℃)提高12℃； 用DEAE—纤维素固定化，其最适温度(67℃)比游离酶提高7℃； 用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶则有所降低。 （4）酶的最适pH值 酶固定化后，对底物 作用的最适pH和酶— pH曲线常发生偏移 原因：微环境表面电荷