第五章植物细胞培养及原生质体培养规范.ppt

Brassica leaves at the start and end of incubation in enzyme solution Freshly isolated potato protoplasts Two protoplasts ready to fuse together Putative somatic hybrid plants 杂种植株的筛选 方法同花药培育植株倍性 的鉴定。 Somatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant 2. 物理融合： 包括显微操作、离心震荡、激光照射及电融合等，其中电融合应用最普遍。 进行电融合时，将一定密度的原生质体悬液置于一个融合小室，小室两端装有电极，在不均匀的交变电场作用下，原生质体细胞彼此靠近，紧密接触，在两个电极间排列成串珠状，此时，若是以强度足够的电脉冲，就可使质膜发生可逆性电击穿，从而导致细胞融合。 二、融合过程： PEG法融合采用 23%-30%的PEG处理高密度混合细胞，细胞密度达到2×105个/ml。 电融合：细胞先在交流电场中聚集，然后通过直流脉冲融合。结合融合特定的缓冲液体系，可完成高效的细胞电融合。 技术参数：融合模块电压 5-300V 脉冲宽度 0-300ps，按5μs递增脉冲形式 方波 多脉冲 1-99，间隔1秒 矩形电压 1-l0Vp，以0V对称 频率 2MHz 时间范围 脉冲前后0-95秒 火鹤与白鹤芋原生质体融合及融合细胞形成（图片引自Plant Cell Tiss Organ Cult，2007， 91: 165–173） 三. 影响融合的因素： PEG, 高Ca2+ 高pH处理时间以及电融合条件等。 四. 杂种细胞的筛选技术： 1. 显微筛选技术：显微镜下挑选异核体，可通过荧光染料标记筛选。 2. 互补筛选技术：根据抗性等表型互补特征进行筛选。 3. 遗传标记筛选技术：利用隐形非等位基因互补筛选体细胞杂交种。 4. 再生植株的性状筛选： 生物学性状；细胞学鉴定；生化指标；分子生物学方法鉴定。 Potato leaves suspended in wall-dissolving enzyme solution Protoplasts float to top in sugar solution Potato leaf protoplasts immediately after digestion of cell walls 叶肉细胞经酶解去壁获得原生质体 非洲百合原生质体培养和植株再生（Agapanthus praecox）（图片引自Plant Cell, Tissue and Organ Culture ，2003，72（1）：63-69） 球根鸢尾原生质体培养和植株再生（图片引自Euphytica，1999，105: 99–102） 针叶石竹叶片原生质体培养及植株再生（图片引自In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 2005, 41:794–800） 仙客来原生质体培养及体胚途径再生（图标引自Plant Cell Tiss Organ Cult, 2010, 101:171–182） 一、原生质体培养的意义 （1）原生质体可以作为体细胞无性系变异和突变体筛选的材料； （2）利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取(病毒、微生物、外源遗传物质)； （3）原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。 （4）是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。 （5）也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。 自1970年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。 (一) 原生质体的制备： 1、材料来源与预处理： （1）材料来源： 可以采用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。 （2）预处理： A.预质壁分离：17-20 ℃ 酶液中静置半小时，再于28—34℃保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的； B. 预培养: 将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高； C. 暗处理: 将室温下生长5—7个星期的植物材料在黑