基因工程5. 基因克隆载体-质粒.ppt

基因克隆载体 生物与食品工程学院 1. 载体的概念 克隆载体是一种能携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中得以维持或表达的DNA分子。 生物学本质：质粒、噬菌体、动植物病毒改造后的产物。 特 点：能在受体细胞内稳定存在和复制。 2. 载体的一般特征 1. 容易进入受体细胞 2. 自主复制 3. 筛选标记 4. 多克隆位点 5. 安全 3.载体的种类 1. 质粒载体 2. 噬菌体载体 3. 病毒载体 4. 质粒 生物学本质：细胞内染色体外的遗传物质。广泛存在于细菌细胞中，也出现在某些蓝藻、绿藻、眼虫、衣藻和真菌等细胞中。 结构特征：供价闭环双链环状DNA。 4.质粒 4.显性质粒与隐蔽质粒 是否能使宿主细胞呈现出新性状。 受检测手段的限制，现定为隐蔽性的质粒，未必是真正的隐蔽质粒。 4.常见的显性质粒 F 质粒 结合作用 R 质粒 抗生素的抗性质粒 Col质粒 大肠杆菌素合成基因 降解芳香烃、农药等毒物的降解质粒 诱导植物形成冠瘿廇的Ti质粒 4.质粒迁移 自然条件下，某些质粒能通过结合作用转移到新宿主细胞内。 质粒的转移受一系列基因的控制 细菌产生鞭毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞结合，导致质粒从一个细胞转移到另一个细胞 接合质粒 非接合质粒 4.质粒的复制 在质粒复制过程中，同时会合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，合成的阻遏物累积到阻止质粒继续复制的程度，质粒复制停止。 严谨型质粒 松弛型质粒 失控的质粒载体（温度） 4.质粒的不亲和性 两种质粒可能共存于同一宿主细胞之中，有的则不行。 1. 受相同的阻遏物阻止。 2. 相同的膜结合位点。 受体细胞最好不含内源质粒 5.质粒的提取 氯化铯梯度离心 EtBr嵌入的差别 碱变性法 6. 构建质粒克隆载体的策略 1. 复制起始点 2. 限制性酶切位点 3. 标记基因 4. 载体本身应尽可能小 5. 根据需要组装各种小原件 pSC101质粒 第一个用于克隆真核基因的大肠杆菌质粒载体 有四环素抗性基因 含有EcoR I等酶的酶切位点 严谨型复制质粒 ColE1 质粒 编码大肠杆菌毒素E1基因和使宿主细胞对E1免疫的基因 pBR322质粒 pBR322质粒是由多个质粒通过DNA重组技术构建的质粒。 pSC101质粒 四环素抗性基因 ColE1 - pMB1质粒 提供复制起始点 R1drd19质粒 氨苄青霉素抗性基因 缩小体积 pBR322 质粒 大小： 4.3 kb 抗氨苄青霉素 抗四环素 抗性基因内部酶切位点 抗性基因外部酶切位点 pBR322 质粒的使用 使用同一种酶切割pBR322和目的基因 正确连接目的基因的质粒 自身连接的质粒 细菌没有吸收 pBR322 质粒 通过筛选基因进行筛选 pUC18/19 pUC18/19 由pBR322衍生构建而成 删除了pBR322的抗四环素基因 保留氨苄青霉素的抗性基因 添加乳糖操纵子的一个片段lac Z’（启动子、调节因子、β-半乳糖苷酶的α-肽基因） 添加多克隆位点 MCS pUC18/19 TA载体 TA载体是针对PCR而设计的一种质粒载体 耐热性DNA聚合酶（Taq酶）具有一种非模板依赖活性，可在PCR产物的3’端加上一个非配对的A，根据该特性，设计出一种5’端带一个不配对的T，通过该质粒，可以直接将PCR产物以TA连接方式进行克隆，即TA克隆。 质粒表达载体 在克隆载体的基础上添加表达原件，构建成表达载体。在受体细胞内可以稳定维持并表达外源目的基因。 融合型表达载体 pGEX 非融合型表达载体 pKK223-3 分泌型表达载体 pinIII 影响质粒稳定性的因素 1. 代谢负荷 有质粒的细胞代谢负荷大，复制慢 2.拷贝数差度 细胞个体之间质粒拷贝数的差 3. 重组体系 质粒重组后以2倍的速度进行复制 Thank You