2.1_基因工程载体-质粒载体_201209.ppt

1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选 五、典型的质粒克隆技术 3）连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 冷循环器 4）用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。 5）细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选 筛选会有三种结果： 一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成； 二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落； 三是要插入的序列与质粒相连，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。 筛选结果模式图 F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合（conjugation），通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递 含有的lacZ基因编码了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外源DNA后，α片段不能正常合成 Ampr ORI Tetr pBR322质粒：一种克隆质粒 ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。 结构： Ampr, Tetr： 两个抗性基因用于 筛选阳性克隆。 Pst I, BamH I： 两个单酶切位点用于插入目的基因 Ampr LacZ MCS pfxBlue: 克隆质粒 MCS：Multiple Clonning Site 提供多个单酶切位点用于克隆操作 LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆 三、常用质粒载体类型 1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿梭质粒载体 1、克隆质粒载体 克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体。 pBR322质粒 pUC系列的质粒载体 利用菌落颜色筛选重组子 2、表达质粒载体 是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体 根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体 根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体 表达载体与克隆载体的区别 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性 表达型载体（expression vector） 特点 基因的启动子序列和终止子序列 一般无检测标记基因 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后） 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。 结构 转化单元--宿主细胞转化 表达单元--外源基因表达 表达型载体（expression vector） 类型 Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子 Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体） 三种表达型载体结构图 表达型载体（expression vector） 显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定, 表达载体的类型也就确定了。 用途 表达外源基因以产生大量外源基因产物 用于构建cDNA文库 3、多功能质粒载体 载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。 pGEM 系列质粒载体就是一类多功能载体，如： pGEM-3、 pGEM-4、 pGEM-3Z、 pGEM4Z 、pSP64、 pSP65、 pGEM3Zf。 pGEM系列载体 pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。 在其总长度为2743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ’基因。 在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。 此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。 pGEM3Z载体 pGEM3Z与pUC载体非常相似 ，其不同点： pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。 这两段启动子（噬菌体SP6\T7)存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录。 合成的RNA可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。 2743 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr Pgem-3E PSP6 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受