2017整理9、多克隆抗体的制备.ppt

多克隆抗体 （高免血清）制备技术 一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，经反复多次注射同一动物体，所生产的一类高效价抗体，主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛奶抗体等 高度免疫血清简称高免血清（hyperimmune serum），又称免疫血清（immune serum）或抗血清（antiserum） 分为抗病血清和抗毒素 一、作用机理 含有特异性的免疫球蛋白—抗体输入动物体后，动物即可被动地获得了抗体，从而形成免疫力，即所谓的人工被动免疫。 当动物已感染某种病原微生物时，注射大量的抗病血清后，可抑制动物体内的病原体继续繁殖，并协助体内正常防御机能，消灭病原微生物，使病畜逐渐恢复健康。 二、应用 用作紧急预防注射。优点是注射后立即产生免疫，疫苗是起不到这种作用的。 维持时间较短，一般仅2～3周。在注射血清后2～3周仍需再注射一次疫苗，才能获得较长时间的抗传染能力。 目前生产较多的抗病血清有：抗炭疽血清、破伤风抗毒素、抗气肿疽血清、抗猪瘟血清、抗小鹅瘟血清、抗传染性法氏囊病血清和抗犬瘟热血清等，其中，破伤风抗毒素血清的效果最佳，应用最广。 三、动物的选择 1. 动物的品种 制备高免血清用马较多，血清渗出率高，外观颜色好 也可用多种动物制备一种抗毒素血清，以避免发生过敏反应或血清病 选定动物应有一定的数量，一个批次应用多头动物 2. 动物的年龄及健康情况 通常选择体型较大、性情温驯、体质强健的青壮年动物为宜。 马以年龄3～8岁、体重350kg以上者为宜； 牛以3～10岁、体重300～400kg以上为宜； 猪以50kg以上，年龄6～12月龄为宜； 家兔体重需达2kg以上为好。 动物必须从非疫区选购，经过严格检疫,并经隔离观察，每日测温两次，观察二周以上，确认健康者方可应用。 最好自繁自养或由专门饲养场提供标准化的SPF或其它级别的动物 对某些购进的动物进行必要的和对制备抗血清无影响的预防免疫接种 四、动物的管理 由专人负责喂养和精心管理 隔离饲养，建立档案 喂以营养丰富的饲料，并加喂多汁饲料 在高度免疫和采血期间，每日要检测体温两次，随时观察其健康情况。每日至少运动4h。 动物采血前1d，禁食喂水，避免血中出现乳糜。 在生产过程中，若发现健康状况异常或有患病可疑 时，应停止注射抗原和采血，并进行隔离治疗。 五、免疫原 异物性、结构的复杂性和一定的物理性状。 颗粒性抗原较可溶性抗原的抗原性强 球形分子的蛋白质较纤维形分子的免疫原性强 聚合状态的蛋白质较单体状态的蛋白质免疫原性强。 分子量较小和抗原性较低的蛋白质应吸附于载体上，才可获得较高的免疫原性。 1.抗细菌免疫血清制备 基础免疫用抗原多为疫苗或死菌 高度免疫的抗原，一般选用毒力较强的毒株。 多价抗病血清用的抗原，要求用多血清型菌株。 菌体培养 固体培养基上繁殖，加适量灭菌生理盐水或PBS洗下菌苔，制成均匀的菌悬浮液 液体培养基培养，对数期收获 通常活菌抗原需用新鲜培养菌液，培养时间较死菌抗原稍短为好，多用16～18h培养物 经纯粹检验，无杂菌者，即可作为免疫抗原 为减少由培养基带来的非特异性成分，可通过离心，弃上清，再将菌体制成一定浓度的细菌悬浮液，作为免疫原。 2.抗病毒免疫血清制备 以病毒为免疫原，须通过反复冻融或超声裂解方法，将病毒从细胞中释放出来，并尽可能地提高病毒滴度和免疫原性。 3. 抗毒素血清制备 免疫原可用类毒素、毒素或全培养物（活菌加毒素），但后两者只有在需要加强免疫刺激的情况下才应用，一般多用类毒素作免疫原。 六、免疫程序 先用本病的疫苗按预防剂量作第一次免疫 经1～3周再用较大剂量的灭活苗或活菌或特制的灭活抗原再免疫1～3次 基础免疫大多数1～3次即可，抗原无须过多过强，可为高度免疫产生有效的回忆应答打下基础。 （二）高度免疫 亦称加强免疫，一般在基础免疫后2～4周开始进行。 注射的抗原采用强毒制造，微生物的毒力越强，一般免疫原性越好。 免疫剂量逐渐增加，每次注射抗原间隔时间为3～10d，多为5～7d，高免的注射次数要视血清抗体效价而定。 （三）免疫途径 一般采用皮下或肌肉注射 如果免疫剂量大，应采用多部位注射法 免疫程序的制定 掌握抗体消长规律，适时免疫和采血尤为重要。 不能机械地定期免疫和采血。 应给免疫动物足够时间休息，解除免疫抑制作用，并调整免疫程序。 七、血液采集与血清提取 按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验（试血），血清效价达到合格标准时，即可采血。 不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者淘汰。 （一）采血次数和方法 效价高峰在最后一次免疫后的7～10d。 采血可以全放血或部分采血。 放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血脂过高。 豚鼠由心脏穿刺采血 家兔可以从心脏采血或颈静脉、颈动脉放血，少量采血可通过耳静脉采