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11.8.3 单克隆抗体 回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？ 细胞融合 （Cell fusion）是指使用人工方法使两 个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。 体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传 重组，在育种方面意义重大。 杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。 基础知识回顾 免疫学基础 1 抗原 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。 包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、 各种细胞等。 特点：外源性、结构性 （分子具有表面稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。 2 抗体P238 动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白 （Immuniiglobbulin,Ig）。 互补性决定区（Complementarity determining region，CDR） VH 和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位（Antigen-binding site）。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的多样性与特异性。 多克隆抗体与单克隆抗体 动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族， 因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。 单克隆抗体和多克隆抗体的比较（见下页） 3. 干扰素 脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生的一组抗病毒蛋白质。可影响细胞的运动和免疫过程，也可干扰多种病毒的复制而得此名。 分子量数百至数千不等。 工程菌表达为主。 问题的引出 血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。 如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的 B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？ 问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？ 很难离体培养B淋巴细胞。 （一）历史发现 1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠的脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。 病毒诱导制备转化脾细胞 有人直接取出健康的活化脾细胞，在培养中加入病毒体外诱导，以获得能永久生长的特异脾细胞系。 这种方法工作量大、难度高，在制备人用单抗时比较有用。 （二）杂交瘤技术 将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydridomatechniquete）。 单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于生物学和医学研究领域： 1.作为亲合层析的配体 2.作为生物物治疗的导向武器 3.作为免疫抑制剂 4.探针 5.作为医学检验试剂 1.免疫原的制备 ： 完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体 2.小白鼠免疫及脾脏细胞获得 1) 小白鼠 (BALB/c) 先以目标抗原 (如菌体) 免疫，2) 抗原需加 佐剂 (adjuvant, 如 TiterMax) 制成乳剂，3) 打入小鼠体内慢慢释出 (免疫流程)，4) 诱使 B 细胞成熟增殖并生产抗体，5) 然后取出脾细胞 (大多为 B 细胞) 。 2) 注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该不会散去。 也可以在 电泳后，切出所要色带，胶体装入乳化针筒，加入佐剂 直接制成乳剂，可有相当好的免疫效果。 3 ) 有人直接取出健康的脾细胞，在培养中加入抗原进行体外免疫；或打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。 近来更流行以抗原的 DNA 种入肝脏中，以此 DNA 的表现产物，直接在生物体内诱发免疫反应。 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍实行旧法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应还是最可靠。 4）注意免疫过的脾脏被大量结缔组织包裹,分离起来比正常脾脏困难一些，如果不能完整的分离，可以分小块分离。 将小鼠两后肢交叉固定(左后肢在上以便于脾脏的暴露)，用小镊子在远离