双缩脲法测定蛋白质的浓度.ppt

双缩脲法测定蛋白质的浓度 相关知识 目前常用的有四种经典方法： 　定氮法：灵敏度0.2~1.0mg 　双缩尿法（Biuret法）：1~2mg 　Folin－酚试剂法（Lowry法）：50~100μg 　紫外吸收法：5μg 　考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg 　 双缩脲 双缩脲反应:碱性环境　 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O ? 紫色络合物 双缩脲试剂 蛋白质含有两个以上的肽键（与双缩脲中肽键相似），因此有双缩脲反应。 比色分析法 溶液的颜色和光的选择吸取、光的吸收定律：T%与A或E 　A＝εCL 一、实验目的 掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 学会使用721或7220型分光光度计并了解仪器的基本结构。 二、实验原理 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。 在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540－560毫微米下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 除－CONH－有此反应外，－CONH2－，－CH2－NH2，－CS－NH2等亦有此反应。 三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器 吸量管（1毫升，2毫升，5毫升）、试管及试管架、721或7220型分光光度计。 （二）材料 1．? 标准蛋白溶液(2~5mg/ml)、? 未知液 （三）试剂 1．双缩脲试剂　溶解0.175克硫酸铜（CuSO4.5H2O）溶于15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h，再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。 四、实验操作步骤 　（一）? 绘制标准曲线 　（二）未知样品蛋白质浓度的测定 　 1．取12支试管 6支分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准 　　　6支分别加入1毫升不同稀释浓度的待测液（两两相同）。 　　2.分别加水补足到2毫升。 3.分别加入4毫升双缩脲试剂在室温下放置30分钟。 4.在540毫微米波长下7220型分光光度计比色、读数，记录各管A值。 ．? 五、实验结果与讨论 前6管每管蛋白的含量为横坐标绘制标准曲线。 待测液中选择吸光值在标准曲线范围内的作为计算基础。求出待测液蛋白含量是？单位mg/ml * * N 端 C 端 加热 ＋　NH3 2 2 H－ 1800 双缩脲 2 2 2 2 2 *