双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量--修订版.ppt

* 双缩脲法（皮尼克法）测定面粉中蛋白质的含量 蛋白质含量的测定法: 定氮法 ：灵敏度0.2~1.0mg；凯氏定氮法比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 双缩脲法(Biuret法) ：灵敏度1~2mg；双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 Folin -酚试剂法(Lowry法)：灵敏度50~100μg；灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍；较双缩脲法灵敏100倍左右。但此法要费较长时间，进行测定时，加Folin 氏试剂时要快速，防止该试剂被破坏。 紫外吸收法：灵敏度5μg；简单、灵敏、快速不消耗样品，准确度较差； 考马斯亮蓝法( Bradford法)灵敏度1~5μg 。迅速、敏感，干扰物质少。 一、目的要求 1．学习双缩脲法的基本原理及操作。 2．通过实验学会制作标准曲线。 二、实验原理： 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫红色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。 测定范围为1-10mg蛋白质/ml。 三、操作方法 20/6 16/6 12/6 8/6 4/6 0 浓度（mg/ml） 0 A540 混匀，放置30分钟 4 4 4 4 4 4 双缩脲试剂(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 蒸馏水(ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0 酪蛋白(ml) 6 5 4 3 2 1 管号 混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号调0，测定各管吸光度（重复三次） ，以吸光度（OD）为纵坐标，酪蛋白的浓度（mg/ml）为横坐标绘制标准曲线。 1．标准曲线的制作：酪蛋白：10mg/ml。 1．0.2g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂于干洁锥形瓶中； 2．振摇10分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置30分钟； 3．离心，3800rPm，离心15分钟； 4．取上清比色：OD 540 nm＝？；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂。） 五、计算 面粉中蛋白质的百分含量％＝ C ×25.5 200 ×100 C：OD值所对应的蛋白质浓度 四、样品处理 注意事项： （1）移液管：量程相近、液面相切； 台式天平：配平、左物右码； 台式离心机：配平、对称、缓慢启动； 分光光度计：预热、波长、比色池个数设定、校零、测定； （2）本实验方法测定范围1～10mg蛋白质/ml。 （3）标准曲线绘制和样品测定应使用同一台分光光度计。 （4）显色后30min内比色测定。30min后，有雾状沉淀发生，各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 （5）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。 红外分光光度计:测定波长范围为大于760 nm的红外光区 可见光分光光度计:测定波长范围为400~760 nm的可见光区 紫外分光光度计:测定波长范围为200～400 nm的紫外光区 分光光度计的分类： 分光光度计的基本结构： 无论哪一类分光光度计都包括5个基本部件：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示: 比色池盖 操作面板 显示屏 比色池 比色杯架 电源开关 T6新悦－可见分光光度计 T6新悦－可见分光光度计操作面板 T6新悦－可见分光光度计快速操作指南： 一、开机自检：打开仪器主机电源，仪器开始初始化；约3分钟时间初始化完成。 SELF - 1 busy... PASS SELF - 5 busy... PASS 初始化完成后，仪器进入主菜单界面。 Au - 0.001 660.8nm 吸光度测量模式 当前波长显示 吸光度显示 二、设置测量波长：在上图状态按 GOTOλ键 ，设置所测量的波长，如下图。例如需要在680nm测量，输入680后按 ENTER 确认。 _ 660.0nm 当前工作波长 波长输入提示光标 三、设置样品池个数：按 键，进入系统设置界面，如下图所示： SHIFT RETURN 6 SH 设置状态 钨灯