凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量.doc

PAGE 1 实验 凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量 一、实验目的与要求： ??1. 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。 2. 掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。 二、实验原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。。吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。 2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 = (NH4)2 SO4 + 6CO2 ↑+ 12SO2↑ + 16H2O (NH4)2 SO4 + 2NaOH = 2NH3↑ + Na2SO4 + 2H2O 2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2 B4O7 + 5H2O (NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3 三、样品： 面粉 四、仪器与试剂 仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、 微量滴定管、 加热套1000W 试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。 1. 消化试剂：浓H2SO4 硫酸铜(固体) 硫酸钾(固体) 2. 2%硼酸(H3BO3)溶液: 10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。二组配500ml 3. 40%NaOH溶液 4. 0.0100mol/L盐酸标准溶液 5. 混合指示剂: 临用时，把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成(比例5：1)．(公用) 五、测定方法 样品消化： 　　准确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，包好，塞入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5g CuSO4、6g K2SO4及25mL浓硫酸，加数粒玻璃珠，轻轻摇匀后，用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。 为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加4-5ml。注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷却至70-80℃后，方可加入30%浓度的双氧水。 取50~60mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，以释放潜热，待样品冷至室温，移入250mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。 同时做一空白消化（空白消化只加试剂，不加样品）。 2、蒸馏与吸收： ⑴ 组装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处， 加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸(呈黄色)，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 ⑵　将所有的夹子打开。取下样品加入口的磨口塞，从样品加入口加入50mL的蒸馏水，再插回塞好，产生蒸汽后，使蒸汽进入反应室，蒸馏洗涤10分钟。然后排出废水。马上从进样口加入蒸馏水约20mL，再次洗涤反应室，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。 ⑶ 量取25mL2%硼酸置于250mL锥形瓶内，并加入 2滴混合指示剂，然后将此吸收液置于冷凝管下端插入到液面以下。 ⑷ 将全部夹子打开，用移液管准确吸取10.0ml样品消化稀释液（或空白液），从样品加入口流入反应室内，用少量水(10ml)洗涤加入口，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，使反应室内的样液呈碱性，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防止氨的逸出。 ⑸　夹紧螺旋夹，开始蒸馏。 　　从第一滴馏出液滴下开始计时，蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面,再蒸馏1分钟，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液流入吸收液内，取下接收瓶。 （6）反复洗涤反应室后，再作样品平行测定。测定完毕，打开全部夹子，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。 3．滴定： 用0.0100mol/L HCl滴定吸收液至变为紫红色为终点，记下消耗的HCl体积。平行实验进行数次 。 同时吸取 10.0mL 试剂空白消化液按上述操作做试剂空白试验。 注意 ：定氮仪在使用前或每次平行实验后，应用蒸馏水及蒸汽洗涤干净方可进行样品测定的蒸馏操作。 洗净的标志：吸收液不变颜色 四、计算： 公式自己推导。 蛋白质% = C — HCl标准溶液的浓度，mol/L； V1 — 滴定样品吸收液消耗的HCl标准溶液的体积，mL； V2 — 滴定样品空白液消耗的HCl标准