动物组织中氨基糖苷药物残留量的测定高效液相色谱一质谱质谱法.doc

动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱一质谱/质谱法 1 原理 试样中氨基糖苷类药物残留，采用磷酸盐缓冲液提取，经过C18固相萃取柱净化，浓缩后，使用七氟丁酸作为离子对试剂，高效液相色谱一质谱/质谱测定，外标法定量。 2试剂和材料 2. 1 甲醇：液相色谱级。 2. 2 冰乙酸：液相色谱级。 2. 3 甲酸：液相色谱级。 2. 4 七氟丁酸：纯度≥99%。 2. 5 浓盐酸。 2.6 氢氧化钠。 2. 7 三氯乙酸：纯度≥99%。 2. 8 乙二胺四乙酸二钠(Na2 EDTA)：纯度≥99%。 2. 9 磷酸二氢钾。 2.10 七氟丁酸溶液(HFBA) ：100 mmol/L，准确量取6. 5 mL七氟丁酸((2. 4)，用水稀释至500 mL(4℃避光可保存6个月)。 2.11 七氟丁酸溶液：20 mmol/L准确量取100 mmol/L七氟丁酸溶液50 mL(2.10)，用水稀释至250 mL(4℃避光可保存6个月)。 2.12 磷酸盐缓冲液(含0.4 mmol/L EDTA和2%三氯乙酸溶液)：准确称取磷酸二氢钾(2. 9)1. 36 g，用980 mL水溶解，用1. 0 mol/L的盐酸调pH到4. 0，分别加人Na2EDTA(2.8)0. 15 g和三氯乙酸(2.7)20 g，溶解混匀并定容至1 000 mL(4℃避光可保存1个月)。 2.13 甲酸：0.1%(体积分数)，准确吸取1. 0 mL甲酸(2. 3)于1 000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。 2.14 壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素、新霉素标准品：纯度范围92. 0%～99%。 2.15 10种氨基糖苷类药物标准贮备液：分别准确称取适量的每种氨基糖苷类药物标准品(2.14)，用水溶解，配制成浓度为100 μg/mL的标准贮备溶液（4 ℃避光可保存6个月)。 2. 16 l0种氨基糖苷类药物混合标准中间溶液：分别准确量取壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素标准贮备溶液(2. 15)各1.0 mL，新霉素、潮霉素B、安普霉素标准贮备溶液((2.15)各5. 0 mL，于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素浓度为4.0μg/mL，新霉素、潮霉素B和安普霉素浓度为20. 0 μg/mL的混合标准中溶液(4℃避光可保存1个月)。 2.17 10种氨基糖苷类药物标准工作溶液：精密量取标准中间溶液（2.16）适量，用用空白样品基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液(现用现配)。 2.18 固相萃取C18柱：500mg,3mL。 3 仪器 3. 1 高效液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 3. 2高速组织捣碎机。 3. 3均质器。 3. 4旋转蒸发器 3 .5氮吹仪。 3. 6 pH计。 3. 7分析天平：感量0.1mg和0.Olg各一台。 3. 8 真空泵。 3. 9 离心机。 4 试样制备与保 4. 1 试样制备 样品经高速组织捣碎机均匀捣碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后标记，一份作为试样，一份作为留样。 4. 2 试样的保存 将试样于-18℃下保存。 5 测定步骤 5. 1 提取 称取约5g(精确至0. 01 g)试样于50mL聚丙烯离心管中，加入10. 0 mL磷酸盐缓冲液((2. 12)均质2 min，于平板振荡器上振荡提取10 min，离心10 min(4 500 r/min)，将上清液转移到另一个50 mL聚丙烯离心管中。在残渣中再加人10. 0 mL磷酸盐缓冲液(2. 12)，重复上述操作，合并上清液，用1. 0 mol/L的盐酸调pH值为3. 5士0.2，加人2. 0 mL七氟丁酸溶液(2. 10)，涡旋混匀。 5. 2净化 C18固相萃取柱用3. 0 mL甲醇(2.1)，3 mL七氟丁酸溶液(2.11)淋洗后，将提取液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s，先用3 mL七氟丁酸溶液(2.11)淋洗，再用每次3 mL水淋洗两次，弃去淋洗液，抽干5min。用5 mL乙腈一七氟丁酸溶液(2.11) (80-+20，体积比)洗脱，收集洗脱液于精密刻度试管中，40℃氮气流挥去部分溶剂，用七氟丁酸溶液(2.11)定容至1. 0 mL,涡旋混匀后，过0. 2 μm微孔滤膜，液相色谱一质谱/质谱测定。 5. 3 测定 5. 3. 1标准工作曲线制备 制备混合标准浓度系列，壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素分别为50 ng/mL，100 ng/mL，250