利用木糖产琥珀酸重组大肠杆菌的构建.doc

文献综述 前言 近年来，随着和基因的速发展，越来越多的于工业合成领域，辅因子代谢工程的研究也逐渐得到。但由于生物催化过程中很多酶如脱氢酶等与辅因子结合因此辅因子的有效供给对这类酶催化的生物反应过程重要。辅因子代谢工程主要是通过基因工程、代谢调控等方法生物反应中涉及的辅酶或辅因子及其参与的过程，而影响代谢网络[1]。 代谢工程的研究主要集中在对某些代谢途径的放大、添加或失活的操纵。对于进一步提高系统的生产效率辅酶调控重要。目前对于辅酶还没有彻底系统的研究，但辅酶调控为代谢工程的研究提供了新的思路。近年来一些学者发现辅酶还原态与氧化态的比值与生物外部环境的氧化还原态势有通过调节反应环境的氧化还原态势、pH等提高生物氧化还原反应过程中辅酶的有效供给对菌体生长代谢进行调节。有关辅酶系统的研究 NADH和NAD+ 在酶的六大类型中，30%～35%为氧化还原酶。氧化还原酶等方面具有明显的优势，其应用越来越受到重视。而在氧化还原酶所催化的反应中，合成产物的同时会消耗一定量的辅酶，约80%的反应需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，NADH)作为辅酶，10%的反应以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，NADPH)为辅酶，只有很少一部分以黄素(FMN, FAD)和辅酶Q(PQQ)为辅酶。 NAD+(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADH(Nicotinamide Ade nine Dinucleotide Hydrogen，烟酰胺腺嘌吟二核苷酸)是生物代谢过程中一重要的辅酶。NAD+的基本生理功能是维持细胞的生长、分化和能量的代谢；NAD(H)在生物体内的糖酵解、柠檬酸循环和光合作用等过程中，起着电子传递的重要作用[3-4]。NAD＋和NADH参与的多酶氧化还原体系是生物体细胞呼吸链中电子传递过程的主要生物氧化体系，糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分也都是通过这一体系完成的。细胞内NADH/NAD+的水平与细胞所处环境的氧化还原状态息息相关，在许多发酵体系中经常采用调节氧化还原状态的办法来实现对菌体生长和代谢的改变[5]。 调控大肠杆菌中关键酶活的研究 NAD(H)作为辅酶参与了300多种氧化还原反应，并且调控种酶活和基因过程，NADH/NAD+的水平微生物分解代谢具有重要的影响。 细胞的生长需要充足的NAD+来进行氧化，以葡萄糖为碳源进行发酵菌株敲除了pfl和ldh，使其成为生产琥珀酸的潜力菌株NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡，最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖代谢生长[6]。 过量表达了苹果酸酶ME)，使丙酮酸生成苹果酸，进一步生成琥珀酸。该反应过程中，不仅有利于缓解丙酮酸的积累，而且能使多余的NADH生成NAD+，降低NADH/NAD+的比例，恢复了菌株在厌氧条件下的生长和产酸能力[7-8]。过量表达了苹果酸脱氢酶MDH)使草酰乙酸生成苹果酸，进一步生成琥珀酸。该过程也能使更多的NADH生成NAD+，缓解辅酶系统的平衡，恢复了菌株的生长和产酸能力[9]。Goldberg等[10]和Wang等[11]曾研究过在大肠杆菌中过量表达延胡索酸还原酶FUM)，延胡索酸生成琥珀酸，还伴随着NADH向NAD+的转化，恢复了生长能力，生成更多的琥珀酸。 改造在NAD(H)合成途径的研究进展 过量表达辅酶NAD(H)合成途径中关键酶的方法，改造NAD(H)生物合成途径，调控NADH/NAD+比例来提高辅酶NAD(H)的生成，提高琥珀酸的产量。大肠杆菌中NAD(H)合成途径如图1-1所示。 Susana[12]等通过在大肠杆菌中过量表达鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium 中的烟酸转磷酸核糖激酶基因(pncB)，提高了NAD的总量，降低NADH/NAD+的比例，从而使其代谢流发生改变。Liang等人[13]在E.coli NZN111中过量表达pncB基因，提高了大大提高了NAD+的总量，NADH与NAD+的比例降到0.13，使重组菌株在厌氧条件下具有生长和代谢葡萄糖的能力。Heuser等[14]通过在大肠杆菌中过量表达烟酸转磷酸核糖激酶基因(pncB)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶基因(nadE)后，均使细胞中NAD(H)的总量增加了两倍多，通过将这两个基因共表达后，使胞内的NAD(H)的总量增加了7倍多。Ma等[15]人在大肠杆菌BA002中共表达烟酸转磷酸核糖激酶基因(pncB)和丙酮酸羧化酶(pyc)NAD(H)的浓度比出发菌株BA002提高了9.8倍，并且，NADH/NAD+的比例从0.6降到0.04，从而提高菌株的生长和产酸能力。不同还原态碳源提供代谢还原力，影响代谢产物的分布。通过调节产物的分布比例来维持细胞代谢