SN 1151.2-2002对虾白斑病毒（WSV）聚合酶链式反应（PCR）检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1151.2-2002对虾白斑病毒（WSV)）聚合酶链式反应(PCR)检测方法Test method of polymerase chain reaction (PCR)for white spot virus (WsV)2002-11-25发布2003-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标对虾白斑病毒(WSV)聚合酶链式反应（PCR)检测方法SN/T 1151.2--2002*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045电话：6852394668517548中国标推出版社秦皇岛印刷厂印刷*印张 1/2字数 10 千字开本 880×1230 1/162003年3月第一版2003年3月第一次印刷印数 1—2 000*网址 www. 版权专有侵权必究举报电话：（010SN/T 1151.2—2002前言本标准是在参考国际上通用的检测规程和总结我国在这一领域的实践经验的基础上制定的。本标准的附录 A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘、史秀杰、高隆英、江育林。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1151.2-—2002对虾白斑病毒(WSV)聚合酶链式反应(PCR)检测方法1范围本标准规定了用聚含酶链式反应技术(PCR)检测对虾白斑病毒(WSV)的方法。本标准适用于对虾白斑病毒的鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696:1987)3试剂和材料3.1 水应符合GB/T6682一1992中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提）时所用的水要用DEPC处理。3.2 Taq 酶一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。3. 3 dNTP(含 dCTP,dGTP,dATP,dTTP 各 10 mmol/L)引物浓度为40 umol/L。有两对引物，使用时浓度皆为40 μmol/L,其序列分别为：146F1:5-ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG-3;146R1:5-TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A-3,扩增1447bp的片段;146F2:5-GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A-3;146R2:5-TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T-3,扩增上述片段中的941bp片段。3.4无水乙醇分析纯，使用前预冷到一20℃。3.5矿物油无 DNA酶和 RNA酶。4仪器和设备4.1 PCR扩增仪4.2电泳仪4.3微量移液器和吸头4.4紫外观察灯4.5恒温培养箱4.6普通冰箱和低温冰箱 SN/T 1151.2—20024.7电动勾浆器4.8离心机和离心管4.9 剪刀4.10镊子5 白斑病毒 DNA 的鉴定5.1采样取活虾和活虾的头部，立即处理或放在95%酒精中（可在常温下保存30d，样品处理前必须让酒精完全挥发。取 50 mg～100 mg 的鳃丝(或上皮、肝胰腺和肠),放在 1.5mL的离心管中。5.2样品处理在15℃下，首先加人150μL.CTAB溶液（见附录A.1），用小剪刀剪碎，后用均浆器将样品均浆成糊状。再加CTAB溶液到900tL。混勾后于25℃作用2h。5.3DNA 抽提首先加600μL抽提液1（见附录A.2），充分混合至少30s；120001/min离心5min，取上层水相再加700μL抽提液2（见附录A.3），充分混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相；然后加人1.5倍体积的一20℃无水乙醇，混勾后，一20℃放置6h以上；15000r/min离心30min，弃上清，立即用纸吸干,37℃干燥20 min;最后加10αl.水溶解后，作为PCR模板。5. 4 第一步 PCR 扩增 DNA在1.5ml.离心管中加人Taq酶用10倍缓冲液（见附录A.7)10μL、25mmol/l.氯化镁（MgCl²）(见附录 A.6)10 μL、dNTP 2 μL、引物 146F1 和 146R1 各 2.5 μL、Taq 酶(见附录 A.8）5 U、10 μL待测样品DNA为模板，最后加水到100μL水。在反应混合物上覆加50μL矿物油。低