DB22T 1745-2012 弓形虫聚合酶链式反应(PCR)检测方法 .docx
ICS11.220B41
备案号：36036-2013DB22
吉林省地方标准
DB22/T1745—2012
弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法
DetectionmethodofpolymerasechainreactionofToxoplasmagondii
2012-12-21发布2013-01-01实施
吉林省质量技术监督局发布
I
DB22/T1745-2012
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。
本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。
本标准主要起草人：姚新华、苑淑贤、任科研、曹利利、杨金生、程荣华。
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DB22/T1745-2012
弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法
1范围
本标准规定了聚合酶链式反应（PCR）检测弓形虫的原理、实验材料、仪器设备、试剂、操作程序、结果判定及废弃物处理和防止污染的措施。
本标准适用于PCR法检测弓形虫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。
3原理
PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，通过变性、退火、延伸周期性的多次循环，使两个引物之间的特异性DNA片段得到体外扩增。出现1080bp电泳条带为阳性，其它为阴性。
4实验材料
4.1眼科剪。
4.2眼科镊。
4.3称量纸。
4.4一次性注射器10mL。
4.5无菌离心管1.5mL。
4.6薄壁PCR管0.2mL。
4.7琼脂糖。
4.8量筒500mL。
4.9锥形瓶500mL。
4.10吸头（10μL、200μL、1000μL）。
4.11灭菌双蒸水。
5仪器设备
5.1分析天平。
5.2PCR扩增仪。
5.3台式低温高速离心机。
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DB22/T1745-2012
5.4电泳槽。
5.5核酸电泳仪。
5.6紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统。
5.7可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。
5.8恒温水浴锅。
6试剂
6.1本标准所用试剂均为分析纯。
6.2无菌双蒸水符合GB/T6682。
6.3溴化乙锭（EB）溶液10mg/mL：参见附录A.1。
6.4电泳缓冲液50×TAE：参见附录A.2。
6.51.5%琼脂糖凝胶：参见附录A.3。
6.6上样缓冲液：参见附录A.4。
6.710×PCR缓冲液：参见附录A.5。
6.8TaqDNA聚合酶2u/μL。
6.9dNTPs2.5mmol/L。
6.10标准分子量DL2000DNAMarker。
6.11引物与PCR扩增结果：参见附录B1。
7操作程序
7.1样品处理
7.1.1组织样品处理
取病死动物肝、脾、肺、淋巴结等组织10g，磨碎后加生理盐水10mL～20mL制成乳剂，过滤，将滤液3000r/min，离心10min，弃去上清液，取沉淀物加生理盐水悬浮后，3000r/min，离心10min，取沉淀加入等体积虫体消化液（0.1mol/LpH值8.0Tris-HCl，1%SDS，0.1mol/LNaCl，10mol/LEDTA）和蛋白酶K（20mol/L），混匀后置于液氮5min，65℃水浴5min，重复3次操作后，65℃水浴2h，备用。
7.1.2腹水样品处理
取患病或病死动物的腹水3.0mL，加入等体积虫体消化液（0.1mol/LpH值8.0Tris-HCl，1%SDS，0.1mol/LNaCl，10mol/LEDTA）和蛋白酶K（20mol/L），混匀后置于液氮5min，65℃水浴5min，重复3次操作后，65℃水浴2h，备用。
7.1.3阳性对照处理
将虫体（RH株）用消化液（0.1mol/LpH值8.