《南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法》.pdf

DB32/T XXXX—2020 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：江苏省海洋水产研究所。 本标准主要起草人：万夕和、沈辉、乔毅、史文军、王李宝、黎慧、蒋葛、成婕、范贤平。 I DB32/T XXXX—2020 南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法 1 范围 本标准规定了南美白对虾 （Litopenaeus vannamei）肝肠胞虫 （Enterocytozoon hepatopenaei，EHP） 巢式聚合酶链式反应 （polymerasw chainreation，PCR）检测方法的原理、试剂材料、仪器设备、操作 步骤和结果判定。 本标准适用于南美白对虾样品中肝肠孢虫带虫情况的高灵敏定性检测。 其他环境生物和饵料生物，以及非生物样品中肝肠胞虫带虫情况检测可参照此方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T25878—2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 （IHHNV）检测 PCR 法 SC/T7202.2—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第2 部分：PCR 检测法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肝肠胞虫 Enterocytozoonhepatopenaei 一种感染对虾肝胰腺、肠道等器官的微孢子虫，可致南美白对虾生长缓慢，养殖产量严重下降。 4 技术原理 南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应 （PCR)检测方法是以样品DNA 为模板，针对其胞壁蛋白 基因设计两对特异性巢式寡核苷酸序列为引物，在四种脱氧核糖苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶的 合成作用，经过先后两步数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两对引物间的DNA 片段 得到特异性巢式扩增，通过电泳检测扩增片段是否存在。 5 试剂材料 5.1 在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。 5.2 实验用水为无菌蒸馏水或超纯水。 5.3 无水乙醇。 5.4 液体石蜡。 5.5 二氧化氯消毒剂。 1 DB32/T XXXX—2020 5.6 电泳琼脂糖。 5.7 1kb DNA Marker。 5.8 Tris平衡酚。 5.9 TaqDNA 聚合酶 （5U/μL）。 2+ 5.10 10×PCR 缓冲液，无Mg ，随TaqDNA 聚合酶提供。 5.11 氯化镁溶液 （25mmol/L）。 5.12 dNTP （含dATP、dTTP、dGTP 和dCTP 各10mmol/L 的混合物）。 5.13 20mg/mL 蛋白酶K。 5.14 TE 缓冲液、抽提缓冲液、1×电泳缓冲液、6×载样缓冲液。 5.15 10mol/L 乙酸铵。 5.16 酚-三氯甲烷-异戊醇 （25：24：1）。 5.17 核酸染料。 5.18 70%乙醇。 5.19 阳性对照为已知受EHP 感染的南美白对虾样品；阴性对照为已知未受EHP 感染的南美白对虾样 品；空白对照为无菌双蒸水。 6 仪器设备 所需仪器设备按照SC/T 7202.2—2007 中第6 章的规定。所有非一次性使用的器具应经清洗，浸于 -3 新配制的有效氯3.0×10 的二氧化氯消毒剂中5min，经无PCR 产物污染的蒸馏水或超纯水充分淋洗干 净后方可用于检测。 7 操作步骤 7.1 样品准备 取活体或冰冻南