高级生物化学_蛋白质的研究方法.ppt

* 四、测定蛋白质的氨基酸序列 蛋白质被纯化出来，需要进一步获取其基因序列， 最好测定其部分的或全部的氨基酸序列。 　自动氨基酸测序仪 * 五、用抗体探测特异蛋白质分子 抗体是当外源入侵物（包括蛋白质）与脊椎动物体内的免疫系统接触后产生的、能与入侵物特异结合的防御性蛋白质分子。 这种高度特异、高度灵敏的抗体一抗原结合反应现在被广泛地应用于检测微量蛋白的存在情况。 * 目前应用抗体研究蛋白质的方法主要包括下面几种： １.蛋白质印迹 2. 免疫共沉淀 * (一）蛋白质印迹（Western blotting） 是一种使用广泛的检测蛋白质的方法。 这种方法与研究核酸时用的印迹法原理非常类似－－ 蛋白质印迹法是利用抗原一抗体之间的特异结合反应而检测的； 核酸类的印迹法是利用核酸分子之间通过特异碱基配对法则而形成杂交分子这一原理而检测的 * 蛋白质印迹－－ 检测时，蛋白质混合物（一般是细胞抽提物）通过电泳被分开，蛋白质被（一般通过电场的作用）转移到一种特别的膜（如硝化纤维膜等）上，然后让特异的抗体与固定在膜上的特异抗原蛋白结合 抗原一抗体之间结合的高度特异性使得用某种蛋 白质分子制备的特异抗体分子只与膜上的这种蛋白质分子结合，而不与膜上存在的成千上万种其他蛋白质发生相互作用。 * 结合了特异抗体的蛋白质条带可以通过能与结合在抗原蛋白上的所谓“第一”抗体结合的、被一种特异的酶／化学发光基团／荧光基团／放射性同位素标记的“第二”抗体进行显示。 这样我们可以知道与特异抗体对应的抗原蛋白在检测的蛋白混合物中是否存在？相对量是多少？如果蛋白混合物是通过SDS分开的话，被检测蛋白的分子量也一目了然。 * （二）免疫共沉淀（coimmunoprecipitation） 是一种在体外探测两个蛋白分子之间是否存在特异 相互作用的方法。 免疫共沉淀的原理：如果两个蛋白在体外系统中能够发生特异相互作用的话，那么当用两个蛋白中的一个所对应的抗体进行免疫沉淀的时候，另一个蛋白也将同时被沉淀下来。 * 　　　　　　　　 蛋白质的结构分析 * 蛋白质结构包括： 　　　共价结构和非共价结构 　　　静态结构和动态结构。 　　　一级结构 　　　空间结构 * 一、氨基酸序列测定－一级结构的测定 蛋白质的一级结构决定其高级结构，测定一个蛋白质的一级结构是我们认识一个蛋白质结构和功能的前提之一。 * Edman降解法：是肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔·埃德曼（Pehr Edman）首先创立。 质谱技术－－基于串联质谱技术的ＡＡ测序方法 　是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性 　这一特点而设计的 通过测定蛋白质的氨基酸所对应的DNA编码序列上 　读出（从cDNA序列直接读出，或从对应的基因组DNA序列中的外显子序列） * Edman降解法： 原理：首先用标记N末端残基的试剂苯异硫氰酸（PITC),在pH9.0-9.5碱性条件下，与肽链N末端自由的α氨基偶联，生成苯氨基硫甲酰基衍生物（PTC-肽）。然后PTC-肽在酸性中经裂解，环化生成苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）和剩余多肽(N端少一个氨基酸的多肽）。 通过用HPLC或电泳法分析PTH-氨基酸，可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次，结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。 * 优点： 能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列，最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少， 缺点： 由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的，因此当N-端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧