一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定.doc

一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定 为了建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉 及肉制品猪源性成分含量测定方法，分别以猪线粒体DNA的 NADH4基因和16SrRNA基因为靶位点设计猪特异性引物、探 针和通用引物、探针，建立猪源性成分含量测定方法，通过 特异性、灵敏性、线性、准确度及市售肉制品检测，对该方 法体系进行检验和评价。结果表明：建立的猪源性成分含量 实时荧光聚合酶链式反应测定方法体系具有良好的特异性 及灵敏性，最低可检测到0. 4pg/ u L纯猪肉DNA；无论是猪 特异性体系还是通用体系都呈现良好的线性关系（R2均达 到0.999以上）和较宽的线性范围；通过含猪源性成分的 模拟混合肉样检测，样品猪源性成分含量的回收率平均值为 122.27%,说明该方法具有较高的准确度；通过市售肉制品 检测表明该方法可以用来检测实际样品（包括生鲜样品和熟 肉样品）中猪源性成分含量。 关键词：实时荧光聚合酶链式反应；猪源性成分；定量; 肉类掺假 Abstract： This study is aimed to establish a real time PCR ( RT-PCR ) method for quantitative determination of pork-derived ingredients in meat and meat products. The pork-specific primers, universal primers and TaqMan probes were designed for the mitochondrial NADH4 gene and 16S rRNA, respectively, and the established RT-PCR method was evaluated by specificity, sensitivity, linear relationship and accuracy by using it to detect commercial meat products. The method showed a. good specificity and was able to detect 0.4 pg/ u L pork DNA. Both pork-specific and universal systems showed a good linear relationship (R2 0. 999) and a wide linear range. The PCR method showed a high accuracy and the average recovery of pork-derived ingredients in meat mixtures was 122. 27%. It can be used to test both raw and processed pork products. Key words : real time PCR ； pork-derived ingredients； quantification； meat adulteration 分类号：TS207.3 A 1001-8123 (2013) 12-0011-05 近年来，由于价格差异带来的巨大利益诱惑导致肉类食 品“掺杂使假”事件频发，不仅严重侵害消费者利益，而且 对肉类产业造成了巨大伤害。不仅国内此类事件频发，国际 肉类市场也普遍存在肉类食品掺假情况。2013年1月，欧洲 暴发的“马肉”风波，多个欧洲国家卷入其中，极大降低了 肉类消费信心，也给我国肉类进口带来了极大的安全隐患。 目前，动物源性成分检测技术通常建立在对样品蛋白 质、DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的基 础上［1］。蛋白质的肉种鉴定方法多采用免疫学技术对肌钙 蛋白I、h-钙调素结合蛋白等具有物种特异性的物质进行检 测来判定样品中是否含有某种肉种成分［2 - 3 ］。但蛋白质的 肉种鉴定方法具有较大的局限性［4-5］，一般不作为标准制 定方法或仲裁鉴定方法，通常作为快速筛查方法使用。与蛋 白质分子相比，DNA分子除了具有种内保守性高，种间特异 性强的优点外还具有较高的热稳定性，可独立用于物种判别 依据。目前，基于DNA序列特异性的鉴别技术中，基于聚合 酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的动物源 性成分检测技术逐渐成为了发展方向和研究热点，主要包括 有 PCR-电泳法［6-8］、PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)法［9_11］、PCR 测序