实验三 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度.ppt

实验三 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 目的要求 学习考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量测定蛋白浓度的方法，于1976年由Bradford建立。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 几种测定蛋白质含量的方法 考马斯亮蓝染色法的突出优点 1、灵敏度高，比Lowry法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1μg。 2、测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2min即可完成，其颜色可以在1h内保持稳定，且在5~20min之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 3、干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 考马斯亮蓝染色法的缺点 1、由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 2、仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。 * *