蛋白质含量测定考马斯亮蓝法.doc

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法 [实验目的] 学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法 [实验原理] [器材与试剂] 器材 722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂 1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。 2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。 [实验方法] 标准方法 1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。 3.用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g鲜重) = 以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。计算出回归方程。如Y=aX+b 让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度　 　 　 　 　 　 　 　 图1 考马斯亮蓝标准法 根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。 （二）SDS干扰数据和图 表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质 （1.00mg/ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 SDS (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 蒸馏水 0.9 0.8 0.7 0.5 0.3 0.1 考马斯亮蓝 G-250试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 对应的吸光度A595 根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。 图2 考马斯亮蓝SDS干扰实验 理论上，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰，随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。 [结论]： 考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为x mg/ml。 干扰考马斯亮蓝方法的物质中，SDS的干扰分析情况。 [干扰实验结果分析]： 当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。从SDS与蛋白质的作用机理来看，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS 的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。 要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。 [思考与讨论] 1.用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？）2.考马斯亮蓝G-250和R-250各有何特点，在电泳染色方面有何异同？考马斯亮蓝G-250和R-250R-250即三苯基甲烷。每个分子含有两个-SO3H，偏酸性，与蛋白质的碱性集团结合。在一定pH时，染料—蛋白复合物可以被完全解聚。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内(15-20μg)，扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。通常用先固定，再进行染色和脱色的方法。考马斯亮蓝G-2503.试述几种主要干扰物质对考马斯亮蓝G-250蛋白测定法测定结果的影响及其作用机理。4.说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？[1] 王德利等.食品中蛋白质的快速消化简便测定法.黑龙江八一农垦大学学报. 15（4）：80～82 [2]余冰宾.生物化学实验指导.清华大学出版社.2004[3] 南亚,李宏高.考马斯亮蓝G-250法快速测定牛乳中的蛋白质.检测与分析.2007.10(12)：42～42 [4]黄婉玉等.考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量.食品与发酵工业.2009.35(5)