实验基因组DNA提取和PCR扩增分析.ppt

PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 (c) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶DNA的扩增 (a) 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) PCR的主要用途 （一）目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有： 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA 获得已知目的基因片段； 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。 （二）基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。 （三）DNA和RNA的微量分析 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析检测。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 重要的PCR衍生技术 1 不对称PCR 2 反向PCR 3 反转录PCR技术 4 多重PCR（复合PCR） 5 LP-PCR（Labelled primers) 6 gene-Walking(步移PCR) 7 原位PCR技术 8 实时PCR技术( 荧光定量 PCR,real-time PCR) 9 易错PCR 10 tail-PCR 11 搭桥PCR 12 锚钉PCR 13 多功能接头PCR(versatile cassette PCR)、Alu PCR、热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR）.. PCR实验药品与设备 dNTPs Taq或高保真DNA聚合酶 相应的PCR buffer DNA 移液器/PCR扩增仪/电泳仪等 主要设备 仪器名称 厂家 PCR仪 Applide Biosystems 高压灭菌锅 HIRAYAMA 电泳仪 Bio-Rad 凝胶成像系统 Bio-Rad 超净工作台 AIRTECH 微孔滤膜 生工生物工程（上海）有限公司 基因枪及各配件 Bio-Rad 恒温摇床 哈尔滨东联技术开发有限公司 低速离心机 Thermo 恒温培养箱 韶关泰宏医疗器械有限公司 表2 实验中使用的主要仪器 实验步骤 成分 使用量 全式金Taq 酶（预混） 25μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl 总基因组 1μl ddH2O Up to 50μl PCR扩增 以全基因组为模板，利用目的基因引物进行目标片段的扩增。反应体系如下： 实验步骤 PCR扩增 以全基因组为模板，利用目的基因引物进行目标片段的扩增。 PCR扩增目的片段 目的片段通常通过PCR获得，引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与线性化载体的两端一致，特殊应用引物设计请参照技术手册。为保证PCR扩增的特异性及灵敏度，请尽可能选用pfu等高保真酶。PCR每条引物长度至少在35-40bp，包括5’端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20-25bp。 实验步骤 引物设计 pUC19骨架 pUC19 Linearized with SacIHindIII, 实验步骤 35cycle 95℃ 1min 95℃ 30 sec 60℃ 30 sec 72℃ 45 sec 72℃ 10 min 4℃ 取5μl扩增产物以1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。 基因组DNA的提取（以果蝇为例） 预备知识 核酸是重要的生物大分子之一，脱氧核糖核酸（DNA）是核酸的一种，DNA是绝大多数生物（除少数RNA病毒外）记录、存储、传递遗传信息的分子。近年来，分子生物学技术迅速发展，在分子遗传学研究领域的诸多方面涉及到抽提基因组DNA的方法。DNA的提取是进行PCR扩增、Southern杂交、限制性片段长度多态性分析等实验的基础。 二、实验原理 使用消化缓冲液使DNA从细胞内释放出来，65度温育可以加速DNA溶解，酚——氯仿异戊醇抽提可以将蛋白质与DNA分离，冷的异丙醇