高脂和高糖饮食对小鼠肥胖和内脏脂肪的影响.docx

高脂和高糖饮食对小鼠肥胖和内脏脂肪的影响 肥胖是一种代谢性疾病，随着发病率的迅速增加。研究表明肥胖及其所致的并发症可能与巨噬细胞在内脏脂肪组织浸润所致的慢性低度炎症密切相关。有研究显示高脂饮食能导致脂肪组织炎症因子增加, 并伴有巨噬细胞的浸润和亚型分布的改变。单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) 是调节巨噬细胞浸润和募集的主要化学因子, 在维持炎症反应中发挥作用。巨噬细胞分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞, 其中M1型通过增加促炎分子的分泌介导Th1反应来发挥促炎作用, 而M2型主要通过Th2反应在寄生虫、过敏和组织重建反应中发挥免疫调节作用。高脂在诱发肥胖和内脏脂肪中的作用已经明确, 而高糖饮食对于脂肪组织炎症的影响目前尚不明确。本研究主要探讨高脂饮食和高糖饮食对小鼠发生肥胖和内脏脂肪的不同影响。 细胞调湿及检测 实验动物及分组35只C57BL/6小鼠购买于湖南省斯莱克景达实验动物有限公司, 为4周、雄性, 无特定病原体动物级, 按照随机数字表法分为正常饮食组、高脂饮食组和高糖饮食组, 每组10只 (4周基线水平时有5只小鼠) , 在正常饮食组、高脂饮食组和高糖饮食组中分别完全随机分为2组, 其中5只在10周时处死, 另外5只继续喂养至20周时处死, 取血清和附睾旁脂肪悬浮细胞液进行附睾旁脂肪重量、瘦素、MCP-1 mRNA的检测。高脂饮食组喂以含60%脂肪的高脂饲料, 高糖饮食组喂以含60%蔗糖的高糖饲料, 正常饮食组喂以含10%脂肪的饲料, 饲料购买于湖南省斯莱克景达实验动物有限公司, 小鼠饲养于中南大学湘雅二医院医学动物实验中心。 内脏脂肪细胞的分离小鼠颈椎脱臼处死后, 将附睾旁脂肪组织取出置于含磷酸盐缓冲液的培养皿中, 将脂肪组织清洗干净后, 弃去磷酸盐缓冲液, 用眼科剪将其剪至2 mm×2 mm的块状, 将剪碎脂肪组织倒入试管中, 加入二型胶原酶 (C6885 Sigma USA) , 放入37℃温水中水浴30 min, 水浴期间轻轻晃动试管, 待脂肪组织消化成乳糜状, 离心 (转子半径11.5 cm, 4℃, 1500 r/min, 5 min) , 弃上层脂肪组织, 磷酸盐缓冲液重复清洗3遍后用磷酸盐缓冲液重悬细胞, 将悬浮细胞用于后续实验。 血清瘦素水平的测定血清瘦素水平通过酶联免疫吸附测定方法检测 (Millipore) , 严格按试剂盒说明书操作步骤进行。将读取所得数据用Excel软件制成标准曲线并分析。 肝脏脂肪浸润程度的测定取下新鲜肝脏标本后, 先在冰冻切片标本托上倒入一部分冷冻包埋剂胶放入切片机内, 待其凝固, 将组织放于托上, 继续倒入冷冻包埋剂胶包埋组织, 并放入切片机内凝固冷冻包埋剂胶。调整冰冻切片机位置以及参数, 切片厚度设定在10μm, 每切一片用玻片沾住组织, 室温放置10 min后。将组织用油红O染色5 min, 冲洗3遍, 将标本置于荧光显微镜下观察, 拍照。 巨噬细胞及亚型在内脏脂肪组织内的浸润采用流式细胞仪检测, 巨噬细胞流式抗体选择如下:别藻蓝蛋白抗鼠F4/80, 多甲藻叶绿素蛋白抗鼠CD11c, 异硫氰酸荧光素抗鼠CD11b, 流式抗体及流式细胞仪均购于美国Biolengend公司。按照试剂盒说明书操作进行, 上机检测, Flow Cytometer分析数据。将F4/80+CD11b+CD11c+定义为M1巨噬细胞, 将F4/80+CD11b+CD11c-定义为M2巨噬细胞。 MCP-1 mRNA的测定小鼠颈椎脱臼处死后, 无菌操作取内脏脂肪组织, 用Trizol法提取总RNA, 逆转录合成c DNA。MCP-1引物在上海生工生物工程技术服务有限公司合成正反义链, 引物序列如下:5’-CACT-CACCTGCTGCTACTCAT-3’;5’-CTACAGCTTCTTTGGGA-CACC-3’。采用实时荧光定量PCR反应, 设置ABI-PRISM 7000荧光定量PCR仪 (美国应用生物系统公司) , 进行两步法PCR扩增, 在扩增结束后, 制作反应溶解曲线, PCR产物特异性在溶解曲线图中表现呈单一且尖锐的波峰。以限制点的循环数 (threshold cycle value, CT) 值计算目的基因的相对表达量, 实验重复3次。 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析, 符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示, 计数资料用构成比或率表示。各组数据比较前先进行方差齐性检验, 符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析 (ONE-WAY ANOVA) 。不满足方差齐性、正态分布采用非参数检验。P0.05为差异具有统计学意义。 高脂养殖小鼠附睾丸旁脂肪量的测定 小鼠体重及附睾旁脂肪重量及瘦素水平与