基因克隆与表达.ppt

據受體細胞的不同可分為：1．原核表達系統：將外源基因引入原核細胞，並使其在原核細胞中以發酵形式快速高效地表達、合成基因產物的體系。2．真核表達系統：使外源基因在真核細胞中表達的體系。二．原核生物基因結構和表達特點原核生物染色體DNA是裸露的環形DNA，其轉錄和翻譯是偶聯的連續進行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結合，翻譯形成多條肽鏈。3、一般不含內含子（intron），沒有轉錄及翻譯後加工系統4、原核生物中功能相關的基因串聯在一起，形成操縱子。操縱子（operon）：是一組功能上相關，受同一調控區控制的基因組成的一個遺傳單位原核生物基因表達的基本單位（即一個轉錄單位）。共同協調作用，完成某一多肽的表達調控。包括：調控區(調節基因，啟動基因，操作基因)、結構基因5、原核生物中參與轉錄的基因結構：啟動子終止子啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結合並啟動基因轉錄的一段DNA序列。一般長40-60bp，富含A-T堿基對具有保守序列：-10區（pribnowbox）：TATAAT-35區：RNA聚合酶識別並結合啟動子，但並不開始轉錄各種啟動子啟動轉錄能力不同。啟動子強弱取決於-35區和-10區的堿基組成及其間隔序列終止子（terminator，T）:位於基因3’端,給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列6、與轉譯有關的原核細胞結構：——核糖體結合位點轉譯起始密碼子AUG或GUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識別與結合序列三．外源基因在原核表達系統中表達的必要條件：刪除內含子和5’非編碼區外源基因置於強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩定且可有效轉譯，形成的蛋白質不被降解四．影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素：1、啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負調，受IPTG的誘導Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體CI基因負調控。溫度誘導。2、基因劑量：3、核糖體結合位點：SD順序與16srRNA3’末端互補程度。AUG—SD間距離。AUG後的核苷酸五．原核表達載體：?適用於在原核細胞中表達外源基因的載體。主要元件：強啟動子SD順序篩選標誌其他調控基因類型：融合型表達載體：----融合蛋白非融合型表達載體：---天然完整蛋白分泌型表達載體：----產物可跨膜分泌至胞周間隙（一）融合型表達載體PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因技術關鍵：克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點加人工合成的DNA接頭構建位相載體----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA載體部分序列DNA序列位相載體----含有3種讀碼框的系列載體優點：表達效率高產物穩定易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性基因的克隆與表達基因克隆(genecloning)基因表達(geneexpression)-原核基因表達-真核基因表達基因克隆GeneCloning概述克隆載體受體細胞體外重組的策略基因克隆工作流程一、概述確定了遺傳資訊的攜帶者，即基因的盆子載體是DNA而不是蛋白質揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留複製機理提出了中心法則和操縱子學說，破譯了遺傳密碼1973年Cohen完成第一個基因工程實驗經體外重組獲得雜合DNA雜合子轉化入大腸桿菌所需元件：限制性內切酶連接酶載體受體細胞基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通過體外重