基因克隆及蛋白表达.ppt

进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α-肽的表达，因而在加入IPTG和X-gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。第55页，共86页，星期日，2025年，2月5日质粒的提取及酶切鉴定第56页，共86页，星期日，2025年，2月5日第57页，共86页，星期日，2025年，2月5日第四部分：外源基因的原核表达第58页，共86页，星期日，2025年，2月5日外源基因的原核表达外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制以及编码蛋白质的结构和功能的重要方法，亦是制备和生产新型蛋白质药物、新型诊断试剂必不可少的手段。外源基因通过在宿主细胞中的表达可大量获得其产物。第59页，共86页，星期日，2025年，2月5日一、原核表达系统常用的载体及其应用（一）大肠杆菌表达系统（二）大肠杆菌载体的表达方式第60页，共86页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的经典表达系统。优点：遗传背景清晰、目的基因表达水平高、培养周期短等；第61页，共86页，星期日，2025年，2月5日引物设计的基本原则3.引物5’末端的碱基无严格限制当引物的长度足够时,引物5’末端的碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态。可在5’端加上限制内切酶位点,启动子序列或其他序列等,以便于PCR产物的分析克隆。第23页，共86页，星期日，2025年，2月5日引物设计的基本原则4.在一个PCR反应中的一对引物之间不应存在互补序列,特别是3’末端应尽量避免互补,以免形成“引物二聚体”造成引物浪费和非特异性的扩增.5.每个引物的内部应尽量避免形成二级结构,特别是引物的末端应无回文结构.第24页，共86页，星期日，2025年，2月5日引物设计的基本原则(三)引物的GC含量和Tm值PCR引物G+C碱基的含量应保持在45-65%之间，G+C含量一般为40-60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20bp时,Tm=4(G+C)+2(A+T)。第25页，共86页，星期日，2025年，2月5日引物设计的基本原则(四)引物的位置1.引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。2.若以cDNA为模板，则首先应尽量使引物和产物保持在mRNA的编码区域内；其次，尽量把引物放在不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。第26页，共86页，星期日，2025年，2月5日引物设计的基本原则（五)Primerprimer5.0辅助的引物设计步骤及条件优化第27页，共86页，星期日，2025年，2月5日第二部分RT-PCR第28页，共86页，星期日，2025年，2月5日RT-PCR是将RNA反转录和PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA，然后进行常规PCR。第29页，共86页，星期日，2025年，2月5日cDNA合成Superscriptfirst-strandsynthesissystemforRT-PCR是从总RNA或mRNA合成cDNA。RNA量为1ng~5ug。第30页，共86页，星期日，2025年，2月5日ReverseTranscriptase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘1.依赖于RNA的5’?3’DNA聚合酶活性（反转录活性）；2.依赖于DNA的5’?3’DNA聚合酶活性。第31页，共86页，星期日，2025年，2月5日ReverseTranscriptaseRNADNADNA3.RNaseH活性：特异性识别并分解RNA-DNA杂交体中的RNA链第32页，共86页，星期日，2025年，2月5日RT-PCR第33页，共86页，星期日，2025年，2月5日用M-MuLV反转录酶（RNaseH-）进行cDNA第一链的合成RNaseH缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以RNA或者单链DNA做模板由引物起始合成一个互补的DNA链。RNaseH活性的缺失增强了该酶合成长链cDNA的能力。编码M-MuLV反转录酶的基因在重组大肠杆菌中表达，该酶在其RNaseH区域含一点突变，从而使修饰后酶的RNase活性缺失，但反转录功能不受影