基因克隆及蛋白表达.ppt

大肠杆菌载体的表达方式1．非融合性表达载体：此种载体表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋白质在结构、功能和免疫源性等方面基本或完全一致。第63页,共86页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌载体的表达方式2．融合表达载体：分子量较小的蛋白质可采用这种载体进行表达。优点： ①可增加mRNA和表达产物的稳定性； ②可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段 进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化； ③通过融合表达可产生可溶性蛋白；第64页,共86页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌载体的表达方式融合表达载体主要有以下几种： ①谷胱甘肽-S-转移酶（GST）系统； ②β-半乳糖苷酶系统； ③麦芽糖结合蛋白（MBP）系统； ④蛋白A系统； ⑤与纯化标签融合表达以及其他融合系统。第65页,共86页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌载体的表达方式3．带纯化标签的表达载体：目前应用较多的纯化标签有GST-tag,FLAG-tag,His-tag.4．分泌型表达载体5．表面展示表达载体6．带分子伴侣的表达载体?第66页,共86页，2024年2月25日，星期天外源基因的原核表达载体构建及转化第67页,共86页，2024年2月25日，星期天扩增阳性克隆并进行诱导表达pGEX-5x-1载体带有IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导启动子，可以表达外源蛋白的总量可以达到全菌蛋白的30%以上。第68页,共86页，2024年2月25日，星期天SDS电泳将含有目标蛋白的样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分离。利用浓缩胶和分离胶的浓缩效应，电荷效应和分子筛效应对不同分子量大小的蛋白质进行分离。第69页,共86页，2024年2月25日，星期天第70页,共86页，2024年2月25日，星期天WesternBlotGST-Pro-BGST第71页,共86页，2024年2月25日，星期天RNA提取纯化RT-PCR质粒DNAPCR凝胶回收PCR扩增片段目的基因片段T-A克隆转化感受态细胞蓝白斑筛选质粒提取、酶切鉴定连入GST融合表达载体外源基因克隆到真核表达载体GST融合蛋白表达转化、活性测定转染真核细胞表达定位得到目的基因片段的T-A克隆第72页,共86页，2024年2月25日，星期天Northern印迹杂交是用于检测和量化细胞RNA的一种基本技术。它主要是将电泳凝胶中的RNA转移到尼龙膜上，通过紫外交联作用而使RNA与膜永久的结合在一起，固定在膜上的RNA样品与特异的探针杂交，从而对感兴趣的RNA进行定位。Northern印迹杂交第73页,共86页，2024年2月25日，星期天Northern印迹杂交一、DNA探针标记在核酸分子杂交中，探针是指用放射性核素或其他标记物标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够和待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的特定基因。第74页,共86页，2024年2月25日，星期天Northern印迹杂交一、DNA探针标记用于探针标记的标记物有放射性核素与非放射性核素两大类，前者是目前最常用的标记方式；后者包括生物素、地高辛及荧光素等。第75页,共86页，2024年2月25日，星期天Northern印迹杂交一、DNA探针标记核酸探针的标记方法：1.切口平移法2.随机引物法这是近年来发展起来的较为理想的核酸探针标记方法。第76页,共86页，2024年2月25日，星期天Northern印迹杂交一、DNA探针标记第77页,共86页，2024年2月25日，星期天Northern印迹杂交一、DNA探针标记--随机引物法1.25ngDNA溶解在5～20μl蒸馏水中，沸水浴5min后，立即置于冰上。2．在冰上加入以下成分：dATP2μldGTP2μldTTP2μl随机引物Buffer15μl[α-32P]dCTP5μlddH20至49μl第78页,共86页，2024年2月25日，星期天Northern印迹杂交3．加入1μlKlenowFragment，混匀，做短暂离心。4．25℃孵育1hr。5．加入5μl终止液。第79页,共86页，2024年2月25日