配子与胚胎生物技术课件.ppt

冷凍長期保存牛、綿羊、山羊的胚胎經冷凍解凍後能夠存活，且移植後均可受胎產仔。在冷凍前需先依次經過含有由低濃度到高濃度防凍劑的杜氏培養液，防凍劑的最高梯度為1.0～1.5mol/L。每種濃度中停留5～10min，在最後一種濃度中降溫冷凍。胚胎冷凍時必須採取緩慢降溫。由室溫降至-5℃～-7℃，每分鐘降1℃，在此溫度下進行誘發結冰，然後按每分鐘降0.3℃～0.5℃的速度降至-33℃～-38℃，此後可直接浸入液氮保存。解凍時不必控制升溫速度，可直接放在室溫條件下（20℃～25℃）或在35℃～37℃水浴中解凍。解凍後必須再把防凍劑清除掉。方法是使胚胎按相反的方向（由高濃度向低濃度）依次通過含有不同濃度的防凍劑的培養液，最後移至不含防凍劑的培養液中進行移植。牛胚胎冷凍較新的一種方法是在塑膠細管中進行冷凍，一端裝有胚胎和冷凍培養液，另一端為蔗糖液，解凍後隨即被蔗糖液稀釋，以沖淡防凍劑的含量，將塑膠管直接裝入移植器中，然後注入子宮。（七）胚胎的移植胚胎的移植也有手術法和非手術法兩種方式，手術法一般用於所有的動物，主要用於小動物。而非手術法僅適用於牛、馬及馬鹿等大動物1.手術法移植在受體腹部作一切口，找到排卵一側的卵巢並觀察黃體發育情況，用注射器或移植管將胚胎注入到同側子宮角上端或輸卵管壺腹部內（以胚胎發育階段而定）。只需吸取少量的沖洗液連同胚胎一塊注入。2.非手術移植法牛的非手術移植，主要方式是將一只手伸入直腸，先檢查黃體位於哪一側和發育情況，然後握住子宮頸（如同人工授精操作一樣），另一只手將移植管（注射器連接以導管或特製金屬移植器）插入與黃體同側的子宮角內，注入胚胎。（八）供體和受體的術後觀察對術後的供體和受體不但要求注意它們的健康情況，同時要留心觀察它們在預定的時間是否發情。供體在下次發情時即可照常配種，或經過二、三個月再重複作為供體，收集胚胎。受體母畜術後如發情則說明未受胎，移植失敗。第二節體外受精哺乳動物精子和卵子的受精在自然情況下都是在動物生殖道內完成的，將這個生理過程在體外實驗室的培養皿內進行，則稱為體外受精（invitrofertilization，IVF）。一、發展簡史1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞學者Austin分別發現了精子獲能（capacitation）現象，使動物體外受精研究進入了新紀元。1959年張明覺在世界上首先獲得了體外受精的的哺乳動物—試管兔，推動了體外受精研究工作的開展。1978年首例人類試管嬰兒路易斯·布朗（LouiseBrown）誕生。直到20世紀80年代，家畜的體外受精技術才取得突破，尤其是牛的體外受精技術發展迅速。1981年Brackett等用體內成熟卵母細胞獲得試管牛犢，隨後Hanada等（1985）獲得綿羊和山羊體外受精後代，並於1986年獲得體外成熟卵母細胞體外受精的第一頭犢牛。我國學者盧克煥（1987）在愛爾蘭獲得全體外過程的試管牛犢。二、意義1.可以以較低的成本，大規模地批量生產各發育期的動物胚胎。2.作為胚胎移植技術常規服務的一部分。三、技術程式體外受精包括以下步驟：卵母細胞的獲取、卵母細胞成熟、精子獲能、卵母細胞受精和受精後的體外胚胎培養。(一)卵母細胞的獲得和成熟培養1.屠宰場卵巢從屠宰場採集卵巢保持在30℃～35℃，運回實驗室，吸取2～6mm直徑的卵泡。2.活體取卵母細胞20世紀80年代末90年代初，超聲波或腹腔鏡引導經陰道穿刺采卵，吸取有腔卵泡中的卵母細胞的技術問世，這項技術與屠宰後動物卵巢取卵相比，稱為活體取卵（OPU，ovumpick-up）。3.卵母細胞成熟培養選擇卵丘細胞完整，形態良好的卵母細胞進行成熟培養。培養條件是39℃，5%CO2，卵母細胞在培養皿液滴內培養約24h。(二)體外受精1.精子的獲能處理哺乳動物的獲能方法有培養和化學誘導兩種方法。2.受精獲能的精子和成熟的卵子共培養。配子與胚胎生物技術第一節動物胚胎移植胚胎移植（embryotransfer）：將動物的早期胚胎移植到與胚胎相對應生理狀態的雌性受體子宮中，使之發育為成熟的個體。提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的個體稱為受體。一、胚胎移植發展歷史1890年英國劍橋大學WalterHeape首次獲得兔胚胎移植成功。20世紀30年代，在兔、大鼠和小鼠方面進行了更多的實驗，成為實驗生物學中研究受精、胚胎發育等問題的一個重要方法。家畜的胚胎移植，最早是在20世紀30年代在綿羊和山羊方面進行的。在20世紀60年代以來，對家畜胚胎的採取、保存、移植等技