气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及鉴定.ppt

气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及鉴定 气肿疽(Clostridium chauvoei)又称黑腿病或鸣疽，是由气肿疽梭菌引起的反刍动物的急性、发热性传染病。该病主要呈散发或地方性流行，广泛分布于自然界。该菌属细菌纲，芽孢杆菌科，梭菌属，为专性厌氧，是土壤中的细菌，也常在牛、绵羊的肠内容物中发现，尤其存在于各种深部伤口的厌氧环境下。其芽孢可在土壤中存活多年，在一定条件下，可引起各种严重疾病。 简 介 目前用于诊断气肿疽的分子生物学诊断方法主要有PCR等方法，近几年Uzal等建立了PCR扩增16S rRNA以检测本病的方法。2001年Sasaki等建立了用该方法扩增16S-23S rRNA的气肿疽快速诊断方法，他们用该方法检测了42例气肿疽阳性牛。2010年姜丹丹等建立了气肿疽梭菌套式PCR检测方法。然而对气肿疽梭菌单克隆抗体方面尚未有关研究与报道，在此领域的研究却显迟缓，相关文献报道较少，还未引起足够的重视。 研 究 进 展 目前，我国对气肿疽的诊断主要是根据细菌培养、实验室生化试验诊断，其检测速度和准确性均受到一定的限制。迅速、准确地诊断疾病，检测出该病原菌，是防治该菌感染的关键。 鉴于此，本试验利用细胞融合技术制备了气肿疽梭菌单克隆抗体，并对其特性进行了的初步鉴定。气肿疽梭菌单克隆抗体的制备对气肿疽早期的快速临床诊断及治疗提供了依据和新的技术方法，为今后开展的气肿疽早期诊断的胶体金免疫层析试纸条奠定基础。 目的及意义 技术路线 BALB/C小鼠 抗原（气肿疽标准菌株C54-1） 免疫 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 杂交瘤细胞 细胞培养、同时用间接ELISA检测阳性细胞克隆株、有限稀释法再进行三次亚克隆 筛选出所需要的细胞群，继续培养 体内培养（从腹水中提取） 单克隆抗体 图1气肿疽梭菌 （革兰氏染色 1000×） 图2 气肿疽梭菌 （荧光染色 1000×） 1.气肿疽梭菌的培养 结 果 2.间接ELISA方法的建立 表1 抗原最适包被浓度及血清最适稀释度的确定 抗原包被浓度（μg/ml） 阴阳性血清的稀释倍数 1:200 1:400 1:800 1:1 600 1:3 200 1:6 400 1:12 800 1:25 600 200 P N 1.545 0.052 1.499 0.052 1.393 0.052 1.222 0.049 1.079 0.053 0.822 0.050 0.591 0.050 0.310 0.047 P/N 29.71 28.83 26.79 24.94 20.36 16.44 11.82 6.60 100 P N 1.518 0.052 1.386 0.050 1.382 0.051 1.118 0.052 0.974 0.051 0.793 0.048 0.561 0.049 0.280 0.048 P/N 29.19 27.72 27.10 21.50 19.10 16.52 11.45 5.84 50 P N 1.516 0.049 1.331 0.056 1.075 0.053 1.039 0.052 0.867 0.049 0.689 0.051 0.469 0.054 0.314 0.049 P/N 30.94 23.77 20.28 19.98 17.69 13.51 8.69 6.41 25 P N 1.244 0.052 1.138 0.055 1.021 0.051 0.886 0.051 0.676 0.054 0.537 0.047 0.360 0.049 0.219 0.048 P/N 23.92 20.69 20.02 17.37 12.52 11.43 7.35 4.56 注：阳性血清平均OD492值（P）；阴性血清平均OD492值（N）。 表2 抗原的最适包被温度及包被时间的确定 抗原的包被温度及包被时间 37℃ 0.5h 37℃ 1h 37℃ 2h 37℃ 4h 4℃ 12h P 1.386 1.518 1.519 1.520 1.522 N 0.064 0.050 0.051 0.052 0.054 P/N 25.67 30.36 29.78 29.23 28.19 表3 血清最适作用时间及作用温度的确定 37℃血清的作用时间（h） 0.5 1 1.5 2 P 1.222 1.512 1.518 1.520 N 0.049 0.050 0.051 0.053 P/N 24.94 30.24 29.76 28.68 注：阳性血清平均OD492值（P）；阴性血清平均OD492值（N）。 表4 酶标二抗最适工作浓度及最适作用时间和作用温度的确定 酶标二抗 稀释倍数 37℃酶标二抗