单克隆抗体的制备鉴定与应用研究.pdf

抗百日咳丝状血凝素单克隆抗体的 制备、鉴定与应用研究 徐颖华 孟淑芳 张庶民侯启明 雷殿良 中国药品生物制品检定所，北京，100050 【摘要】 目的制备抗百日咳丝状血凝素(FnA)的单克隆抗体(McAbs)，并建立特异、准确的FHA定量检 测方法。方法采用杂交瘤技术制备McAb，以间接ELISA法筛选获得稳定分泌抗FHA．McAbs的杂交瘤细胞 株，并进行了系统的鉴定和纯化，建立定量检测FHA的ELISA方法。结果获得六株分泌抗FI-IA．McAbs的杂 交瘤细胞株，抗体类别均为tsGl(K)，效价达1：105—1：10s，并能特异性识别百日咳丝状血凝素，与流感病毒血 凝素及百13咳毒素无交叉反应，建立了检测FHA的ELISA，灵敏度为1．04剧L，批内变异系数5．49％，批间变 异系数9．31％，平均回收率为94．18％，应用该法测定了国内几大生产厂家送检的无细胞百日咳疫苗原液中 无细胞百日咳疫苗原液中FHA含量的检测，为无细胞百日咳疫苗的质量控制提供了有力的手段。 【关键词】无细胞百日咳疫苗；丝状血凝素；单克隆抗体；ELISA 百日咳丝状血凝素(filamentous 2．单克隆抗体的制备及纯化 hemagglutinin FHA)是由鲍特氏菌属百日咳杆菌产生的一种具有 用FHA加弗氏完全佐剂(Sigma公司)，制成油 粘附作用的蛋白质分子，因对红细胞有凝集作用而 包水状混合物进行小鼠皮下注射，30／上g,／只≥间隔3 得名。与百日咳杆菌粘附和定居在呼吸道器官的上 周后，再以30t培,／只加弗氏不完全佐剂进行小鼠腹 皮细胞有关，是百日咳杆菌致病的重要毒力因子uJ。 腔注射，7—10天后，眼眶取血，间接ELISA法测其血 同时FHA还具有较强的免疫原性，能刺激机体免疫清的效价达1：lo。于融合前3天尾静脉注射FHA 系统产生特异的保护性抗体，至今，已被世界上包括 30t唱／只，以加强免疫。常规方法将免疫的小鼠脾细 中国在内的很多国家作为无细胞百日咳疫苗的主要 。胞与Sp2／O细胞融合，融合细胞置于HAT选择培养 组分之一。本实验目的是制备特异性强、高亲和力 基中，用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清进行 的抗．FHA单克隆抗体，将其用于建立定量检测FHA筛选，将阳性孔杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克 的夹心ELISA法，为无细胞百日咳疫苗的质量控制隆，直至成为单克隆的细胞株为止。再将筛选出来 研究和百日咳鲍特氏菌致病机制的研究提供基础依 的杂交瘤细胞扩大培养，冻存。按常规方法制备出 据。 小鼠杂交瘤细胞腹水。 按文献[2]方法，采用辛酸．硫酸胺法粗提各株 材料和方法 杂交瘤细胞腹水后，再将粗提液过A蛋白亲和层析 1．主要试剂及实验动物 柱，进一步纯化腹水。 丝状血凝素和百日咳毒素本室保存；流感病毒 3．杂交瘤细胞株及其分泌McAbs特性的鉴定 血凝素由本所疫苗三室提供；Sp2／0细胞由本所细胞 3．1杂交瘤细胞染色体计数：按文献[3]方法， 用秋水仙素刺激杂交瘤细胞处于中期分裂相，固定 室提供；基础培养基(DMEM培养基)为Gibco公司产 品；选择性培养基(HAT和HT培养基)和FHA标准后经Giemsa染色，油镜下计数。 品为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗 3．2McAb类和亚类的鉴定：预包被FHA抗原的 反应板，用ELISA法(按说明书操作)鉴定抗体类和 鼠tsG为Jakson公司产品；亚类试剂盒为PIERCE公 rPmteinAFF)为 亚类。 司产品；A蛋白亲和层析柱(HiTrap Amersham Biosciences公司产品；96孔可拆酶标板为3．3