枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因pdh的克隆与表达.pdf

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因pdh 的克隆与表达 1,* 2 1,2 2 石贵阳 , 龚靓洁 , 张梁 ，丁重阳 1．江南大学工业微生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 (214122) 2．江南大学生物工程学院，江苏无锡 (214122) E-mail：gyshi@ 摘 要：本文运用分子生物学手段，根据文献报道的枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶编码序列设 计引物，采用常规PCR 方法获得葡萄糖脱氢酶基因；然后与克隆载体pUC19 连接，转化至 大肠杆菌JM109 中，筛选阳性克隆转化子，测定其序列并与原序列进行比较分析，获得同 源性大于97 %葡萄糖脱氢酶基因；将目的基因与表达载体pET-28a 连接后转化大肠杆菌DE3 conden plus 中，获得成功表达，用细胞粗提液测定的葡萄糖脱氢酶活力为0.003254 U/mg ， 能够为NADH 或NADPH 依赖性羰基还原酶的手性催化提供足够的还原力。 关键词：枯草芽孢杆菌；葡萄糖脱氢酶；表达 1 引 言 生物催化是合成手性化合物很重要的方法，其中生物催化羰基的不对称还原在不对称合 成中占有很重要的地位。生物催化羰基的不对称还原主要是醇脱氢酶和其他氧化还原酶作用 下进行的，同时还需辅酶NADH或NADPH参与。反应由还原型辅酶NAD(P)H提供的氢，在 氧化还原酶的作用下从R或S面进攻羰基生成相应的单一对映体醇。同时辅酶被转化成氧化 型NAD(P)+ 。为了使反应一直进行下去，需要不断地补充还原型辅酶NAD(P)H 。但该类辅酶 非常昂贵，不可能在反应过程中加入化学计量需要的辅酶，因此体系中辅酶再生系统是必需 [1] 的 。 目前的研究表明，葡萄糖脱氢酶是一种广泛使用的辅酶再生系统，它能够使NADH或 NADPH 同时再生，因此成为研究的热点。 葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH，EC7)是可从多种微生物和组织中获 得的一种氧化还原酶，催化下列反应： + + + + β-D-葡萄糖+NAD (NADP ) β-D-葡萄糖酸+NADH+H (NADPH+H ) + + 它特异性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸(D-葡萄糖-δ- 内酯) ，并以NAD (NADP )作为 辅基，测定其产物葡萄糖酸的生成量或NADH(NADPH)在340 nm 处增高的吸光度可以对该 酶或其底物进行量化分析。目前国内外研究者主要从牛的心脏[2] 以及多种微生物的发酵、分 离获得该酶，如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) ，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ，短小芽 孢杆菌(Bacillus pumilus) ，醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) ，嗜盐古细菌 (Halop1ilic archaeon Haloferax mediterranei) ，嗜热酸古细菌(Thermoacidophilis archaebacterium)等。转酮酶缺陷型枯草芽孢杆菌来源的GDH 以其产酶量高、纯化方便而被 人们广泛的接受和应用。而野生型微生物细胞中葡萄糖脱氢酶的酶活低,因此采用基因工程 技术对葡萄糖脱氢酶进行克隆和高表达是解决氧化还原酶辅酶再生的关键。本文作者根据枯 草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因序列设计引物，PCR 扩增出目的基因（gdh ），与表达载体连 接后转化至大肠杆菌进行成功表达，并建立葡萄糖脱氢酶酶活性测定方法。 - 1 - 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 菌株