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高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选的中期报告

摘要：

本研究旨在通过纯化筛选和选育高淀粉酶蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌菌株，并针对其酶基因进行阳性克隆筛选。利用自然采集的土壤样品分离纯化得到了43株枯草芽孢杆菌菌株，其中12株具有较高的淀粉酶和蛋白酶活力。通过酶活力测定和分子鉴定，筛选出了5株最具有潜力的菌株，并进行了深入研究。借助PCR扩增和测序技术，成功地克隆出了这些菌株中的α-amylase、protease和subtilisin等酶基因，并对其进行了序列分析和比较。

关键词：

枯草芽孢杆菌；淀粉酶；蛋白酶；酶基因；PCR

1.引言

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种广泛存在于土壤和植物表面等环境中的细菌，具有多种产酶能力，尤以淀粉酶和蛋白酶等为其代表性特征。淀粉酶和蛋白酶是广泛应用于食品、纺织、饲料等领域的一类重要酶类，因而枯草芽孢杆菌菌株的筛选和培育对于酶产业的发展至关重要。

2.材料和方法

2.1菌株的分离和筛选

自采集土壤样品百余份，通过选用PM2培养基、PDA培养基和TGY培养基等不同类型培养基进行分离培养，筛选获得了43株枯草芽孢杆菌菌株。

2.2酶活力测定

以菌株生长的第二天为基准时间点，1mL菌液在相应温度下振荡培养至不同时间，分别取出无菌EP管离心收集上清液，对其淀粉酶和蛋白酶活力进行测定。

2.3酶基因的克隆和比较

选用5株具有最高淀粉酶和蛋白酶活力的菌株进行人工培育，利用PCR扩增技术克隆出其α-amylase、protease和subtilisin等酶基因，并对比分析不同菌株酶基因序列间的差异和相似性。

3.结果与分析

3.1菌株的分离和筛选

在PM2培养基的筛选过程中，获得了12株活力较高的菌株，其淀粉酶和蛋白酶活力均高于其他菌株。这些菌株在TGY液体培养基上生长良好，且形态特征与枯草芽孢杆菌标准对照菌株相近。

3.2酶活力测定

在37℃的温度下，选定5株菌株生长48h的培养基发酵液、收集其上清液，检测了其中淀粉酶和蛋白酶的活力。其中菌株B8的淀粉酶活力最高，为1228U/mL；菌株S2的蛋白酶活力最高，为181U/mL。

3.3酶基因的克隆和比较

利用PCR扩增技术成功地克隆出了这些菌株中的α-amylase、protease和subtilisin等酶基因，并对其进行了序列分析和比较。结果表明，这些菌株中α-amylase和protease基因序列较为保守，而subtilisin基因存在明显的差异性，表明其对菌株在不同环境下的适应性可能存在一定差异。

4.结论

本研究通过对自然采集的土壤样品中的枯草芽孢杆菌菌株进行分离纯化和筛选，选得了12株淀粉酶和蛋白酶活力较高的菌株，最后确定了5株最具潜力的菌株。通过PCR扩增和酶基因序列比较，可以为后续对这些菌株资源的深度挖掘和开发提供参考依据。