土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定及淀粉酶活的测定.doc

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定及淀粉酶活的测定 摘 要：从饭堂门口和生化楼楼下的土壤中分离、纯化、培养获得七个菌株，其中五个为能分泌淀粉的芽孢杆菌，通过一系列生理生化实验，对其中两个菌株的种属进行了初步鉴定，并对其中一株菌所产的淀粉酶活力进行了测定。 关键字：土壤 芽孢杆菌 淀粉酶 鉴定 活力 土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用,它推动着生态系统的能量流动和物质循环,维持生态系统的正常运转,是生态系统中的重要组成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和气候等综合因素对微生物的影响和作用,同时其生命活动也反映出土壤肥力、土壤改良与植物营养的密切关系。芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一,也是土壤细菌的主要种群之一。 本实验通过小组合作，由老师指导，小组自行设计、进行实验，对土壤微生物进行分离、纯化及鉴定，发酵及产物测定，对学生的实验能力进行一个比较全方面的锻炼和培养。 （1）了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术； （2）掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法； （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法； （4）培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力； （5）对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练； （6）从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。 1.原理及方法概述 1.1原理 1.1.1芽孢杆菌 1.1.1.1形态学特性：芽孢杆菌细胞呈直杆状，0.52.5μm×1.2-10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。热、pH和盐各种多样性的。生孢不被氧所抑制。发现于不同的生境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。）—水解（淀粉酶）—生成麦芽糖（还原糖） （2）在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。.实验材料与用具 2.1材料 土样2种 样品1：生化楼楼下河道边 样品2：菊苑饭堂后门附近 2.2培养基 2.2.1牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 （3g） 蛋白胨（10g） 氯化钠 （5g） 琼脂（15g） 蒸馏水 （1000ml） pH 7.2-7.4 2.2.2淀粉水解试验培养基（淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 可溶性淀粉（2g） 牛肉膏（3g） 蛋白胨（10g） 氯化钠（5g ） 琼脂（15g） 蒸馏水（1000ml） pH 7.2-7.4 2.2.3硝酸盐培养基 甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸mL 乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/醋酸mL）％℃，营养琼脂121℃，用时再混合，） 2.2.9酪素分解试验培养基 脱脂奶粉（5g，稀释到50ml） 琼脂（1.5稀释到50ml） （分开灭菌，酪素110℃，营养琼脂121℃，现用现倒） 2.2.10运动性试验培养基 可溶性淀粉（2g） 牛肉膏(3g) 蛋白胨(10g) 氯化钠(5g)琼脂 (5g) 蒸馏水 (1000ml) pH 7.2-7.4 2.2.11柠檬酸盐试验培养基(制斜面） 氯化钠(5g)　 硫酸镁(MgSO4·7H2O)(0.2g) 磷酸二氢铵(1g) 磷酸氢二钾 (1g) 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 (40mL) 柠檬酸钠(5g) 蒸馏水(1000mL) pH 6.8 2.2.12牛肉汤培养基 牛肉膏(3g) 蛋白胨(10g) 氯化钠(5g) 蒸馏水(1000ml) 琼脂(20g) pH 7.2-7.4和pH 5.2 2.2.13种子培养基 可溶性淀粉（2.0%） 酵母膏（0.5%） 蛋白胨（0.5%） NaCl（0.5%） KH2PO4（0.1%）蒸馏水（100mL） pH=6.0 2.2.14发酵培养基： 可溶性淀粉（2.0%）酵母膏（0.5%） 蛋白胨（0.5%） NaCl（0.5%） KH2PO4（0.1%）CaCl2·2H2O（0.05%）MgSO4·7H2O(0.05%) FeSO4·H2O(0.05%) 蒸馏水100mL pH=6.0 （培养基高压蒸汽灭菌：利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 ℃以上高温（121 ℃）灭菌的方法。） 2.3试剂 1％％％％ɑ-酚萘、3,5-二硝基水杨酸DNS试剂配制㎡㎝的土壤，装入无