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大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh克隆、高效表达及酶学性质研究的开题报告

开题报告：

一、题目：大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh克隆、高效表达及酶学性质研究。

二、研究背景和意义：

苹果酸是一种重要的有机酸，广泛存在于植物、动物和微生物体内。该酸在食品工业中被广泛应用，被用作食品保鲜剂、增值剂和味道改善剂等。苹果酸脱氢酶（MDH）是一种催化苹果酸向丙酮酸和二氧化碳转化的酶，是微生物发酵制备苹果酸的重要关键酶。

目前，已经有许多研究对MDH进行了分离、鉴定和功能研究。但是，有关MDH基因的克隆和高效表达等研究现在仍比较少。因此，本研究旨在通过基因克隆、蛋白表达和纯化等实验手段，研究大肠杆菌MDH酶学性质，为进一步提高酶活性及其生产苹果酸的效率提供参考。

三、研究方法：

1.大肠杆菌总RNA的提取，转录为cDNA作为模板。

2.使用PCR扩增MDH基因，使用下游引物加入His-tag序列以便后续蛋白表达及纯化。

3.将PCR产物克隆至表达载体pET21a中，构建重组质粒。

4.将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行蛋白过量表达。

5.通过Ni2+-NTA亲和层析纯化His-MDH融合蛋白。

6.对获得的重组蛋白进行酶学分析，测定相应的酶学参数（酶活、反应物浓度等）。

四、研究预期结果：

1.成功克隆了大肠杆菌MDH基因并成功表达。

2.获得了高纯度的His-MDH融合蛋白。

3.测定大肠杆菌MDH的最适反应条件，包括最适反应温度、pH值、基质浓度等。

4.对大肠杆菌MDH酶学特性进行研究，最终探讨大肠杆菌MDH对苹果酸的亲和力、催化效率等。

五、研究意义和应用前景：

本研究通过对大肠杆菌MDH基因的克隆和表达，为进一步探究MDH的酶学机制提供了条件。除此之外，本研究还能够为苹果酸的制备工艺提供参考，如利用大肠杆菌MDH酶催化反应，提高苹果酸的产量和质量等。