葡萄糖脱氢酶的酵母表达.ppt

扩大培养 扩大培养提取质粒 pMECA-tEF1-3#，5#，8#，10# 并送往测序 ，结果 pMECA-tEF1-8#，10#正确 根据电泳定量 pMECA-tEF1-8#，10# 各 50 ng/μl 终止子的扩增 同样采用两轮PCR对pGK1 进行扩增 过程同tEF1 第一轮引物为pGK1-1 ， pGK1-4 第二轮引物为pGK1-2 ， pGK1-3 最终得到pGK1-14，23 25 μl *4 酶切连接 酶切体系如下： pGK1-14,23 2 μl pMECA-tEF1 2 μl 10×NEBuffer 2 2.5 μl 10×NEBuffer 2 2.5 μl Hind Ⅲ 0.8 μl Hind Ⅲ 0.8 μl NheⅠ 0.8 μl NheⅠ 0.8 μl ddH2O 19 μl ddH2O 19 μl 总体积 25 μl 25 μl 菌落PCR 筛选30个克隆 引物pGK1-2 ， pGK1-3 扩大培养提取质粒 菌落37℃培养一天后分别接 pMECA-tEF1- pGK1 4#，10#，16#，29# 定量如图： 出现问题后的解决 质粒 pMECA-tEF1- pGK1 4#，10#，16#，29# 送测序没能测动，分析可能是甲基化严重，用trisb细胞重新转化提取质粒后效果理想 连接UGDH 酶切体系： pMECA-tEF1-pGK1 2 μl uGDH 2 μl 10×NEBuffer 2 2.5 μl 10×NEBuffer 2 2.5 μl NdeⅠ 0.8 μl XbaⅠ 0.8 μl NheⅠ 0.8 μl NdeⅠ 0.8 μl ddH2O 19 μl ddH2O 19 μl 总体积 25 μl 25 μl 不同的处理方法收获不同的结果 由于酶切不完全，回收处理，所以切割不完全的条带没有带入连接体系中。这次处理之后效果非常理想，CK组完全没有菌落长出，与之前的连接对比鲜明，之后我们省略了筛选的步骤，直接在最接近理论连接 片段/载体(mol)=3：1 (肉眼可见张势最好)的板上挑取4个单克隆菌落进行培养后，提取质粒，并做了鉴定后送往测序。 pMECA-tEF1-pGK1-uGDH 下一步工作 由于pMECA-tEF1-pGK1-uGDH 量不足，要对其进行扩大培养 再将pMECA-tEF1-pGK1-uGDH 连接到载体 A1114-3上 谢谢大家，敬请指正 大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的酵母表达载体的构建 jiangli 基本技能学习 1.质粒的提取 2.PCR 3.琼脂糖凝胶电泳定量DNA以及切胶回收 4.转化，接菌等基本分子生物学实验技术 实验的开展 1.实验目的：前期工作已经成功试验了葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的表达，表达效果并非十分理想，所以有了在酵母菌中表达的设想 2.实验步骤：